Исследование иммунохимических и биохимических свойств N-концевого фрагмента предшественника натрийуретического пептида В-типа человека

• Автор: Сеферян, Карина Рубеновна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 140 с. : ил.

Оглавление

Список используемых сокращений

Введение

1 Обзор литературы

1.1 Натрийуретические пептиды

1.1.1 Семейство натрийуретических пептидов

1.1.2 Строение натрийуретических пептидов

1.2 Синтез и секреция BNP

1.2.1 Экспрессия BNP в различных тканях

1.2.2 Структура гена BNP

1.2.3 Регуляция экспрессии гена BNP

1.2.4 Процессинг предшественника BNP
1.2.5 Формы BNP в крови
1.2.6 Конвертазы прогормонов, предположительно принимающие участие в процессинге proBNP
1.2.7 Олигомерные формы proBNP и NT-proBNP
1.3 Инактивация натрийуретических пептидов
1.4 Рецепторы натрийуретических пептидов
1.5 Физиологическое действие BNP
1.6 Сердечная недостаточность
1.6.1 Общая характеристика
1.6.2 Гемодинамические изменения в организме при сердечной недостаточности
1.6.3 Использование BNP и NT-proBNP в клинической практике
1.7 Измерение концентрации NT-proBNP в крови
2 Материалы и методы исследования
2.1.1 Создание молекулярно-генетической конструкции рЕТ-23а(+)-NT-proBNP для экспрессии рекомбинантного NT-proBNP в клетках E
2.1.2 Экспрессия рекомбинантного NT-proBNP. Получение лизата кчеток E
2.1.3 Конъюгирование пептидов с белком-носителем
2.1.4 Шшунизация мышей и получение линий гибридолтых клеток, продуцирующих антитела, специфичные к NT-proBNP
2.1.5 Иммуноферментный и иммунофосфоресцентный анализы
2.1.6 ДСИ-эпектрофоргз в полиакриламидном геле
2.1.7 Электрофорез в трис-трициновой буферной системе
2.1.8 Иммунохимическое окрашивание белков, иммобилизованных на
нитроцеллюлозной мембране
2.1.9 Иммобилизация антител на BrCN-активированной сефарозе
2.1.10 Выделение NT-proBNP из плазмы крови методом аффинной
хроматографии
2.1.11 Ферментативное дегликозширование эндогенного NT-proBNP
2.1.12 Хроматографическое разделение белков
2.1.13 Трипсинолиз эндогенного NT-proBNP и дегликозширование
протеолитических фрагментов с использованием гидроксида аммония
2.1.14 Масс-спектрометрический анализ
3 Результаты и их обсуждение
3.1 Получение и очистка рекомбинантного NT-proBNP
3.1.1 Создание молекулярно-генетической конструкции рЕТ-2За(+)-NT-proBNP для экспрессии рекомбинантного NT-proBNP в клетках E
3.1.2 Очистка рекомбинантного NT-proBNP
3.2 Получение моноклональных антител, специфичных к NT-proBNP
3.2.1 Конъюгирование пептидов с белком- носителем и иммунизация мышей
3.2.2 Получение линий гибридомных клеток, продуцирующих антитела,
специфичные к NT- proBNP
3.2.3 Определение эпитопной специфичности моноклональных антител
3. 3 Исследование биохимических особенностей эндогенного NT-proBNP
3.3.1 Изучение взаимодействия моноклональных антител с NT-proBNP,
содержащимся в крови больных с СН
3.3.2 Протеолитическая деградация NT-proBNP и ее влияние на связывание с
моноклональными антителами
3.3.3 Проверка гипотезы о существовании NT-proBNP в крови в виде гомо
гетероолигомерных комплексов
3.3.4 Гпикозилирование молекулы NT-proBNP и его влияние на взаимодействие с
антителами
3.3.5 Определение сайтов гликозилирования NT-proBNP методом MALD1-MS/MS

3.4 Влияние О-гликозширования на иммунореактивность МТ-ргоВМГ, выделенного из индивидуальных образцов плазмы больных с СН
4 Выводы
Список литературы

вазопрессин вызывает сужение артерий и повышение кровяного давления.
Гипертрофия кардиомиоцитов, а также повышенное давление на стенки камер сердца стимулируют синтез и секрецию натрийуретических пептидов ANP и BNP. Они играют важную роль в поддержании компенсированного состояния СН и препятствуют ее прогрессированию. Активация системы натрийуретических пептидов противодействует вазоконстрикции системных, а также почечных артерий, задержке воды и натрия в организме (Рис. 9).
1.6.3 Использование BNP и NT-proBNP в клинической практике.
Вскоре после обнаружения BNP в сердце было установлено, что пептид также присутствует в крови (Togashi et al. 1989). Было показано, что концентрация BNP увеличивается при CH (Mukoyama et al. 1991). Дальнейшие исследования показали, что 1) BNP секретируется в основном из левого желудочка сердца как у здоровых людей, так и у пациентов с дисфункцией левого желудочка; 2) секреция BNP в кровоток прямо пропорциональна степени дисфункции левого желудочка и измерения концентрации BNP могут быть использованы для определения степени дисфункции левого желудочка (Yasue et al. 1994). Davidson и соавторы показали, что концентрация BNP повышалась при снижении фракции выброса левого желудочка. Уровень BNP в крови позволял определять пациентов с фракцией выброса <35% с высокой чувствительностью (отрицательное предсказывающее значение составило 100%) (Davidson et al. 1996). Также концентрация BNP коррелировала с индексом массы левого желудочка и позволяла с высокой чувствительностью детектировать гипертрофию левого желудочка (Yamamoto et al. 1996). Концентрация BNP увеличивалась не только при систолической, но и при диастолической дисфункции левого желудочка (Lang et al. 1994).
Опираясь на результаты первых исследований, было предложено использовать BNP в качестве маркера для определения СН. Основная сложность состояла в низкой концентрации пептида в крови. По данным Yandle и соавторов у здоровых людей концентрация BNP в крови составляла около 20 пг/мл, у больных с СН она увеличивалась до —300 пг/мл (Yandle et al. 1993). Первые методы для измерения концентрации BNP в крови были созданы на основе конкурентного радиоиммунного анализа (Ueda et al. 1988; Itoh et al. 1990). Из-за низкой чувствительности для их проведения требовалась предварительная экстракция пептида из 1-10 мл плазмы крови, что снижало воспроизводимость измерений. В течение последних 15 лет исследования были направлены на создание новых, более чувствительных и воспроизводимых методов для количественного определения BNP в образцах крови. Одновременно проводился поиск