Исследование кинетических характеристик ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга млекопитающих при гипотермических состояниях

• Автор: Матхкор Тхикра Хасан
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Махачкала
• Количество страниц: 128 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Введение

ГЛАВА I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ АЦЕТИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ (АХЭ)

1.1 Структура АХЭ

1.2 Локализация АХЭ

1.3 Функции АХЭ

1.4 Полиморфизм и множественные молекулярные формы АХЭ

1.5 Биосинтез АХЭ и его регуляция

1.6 Третичная структура АХЭ

1.7 Механизм действия и кинетика катализа АХЭ
1.8 Температурная зависимость АХЭ
ГЛАВА II
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Постановка экспериментов
Искусственное снижение температуры тела млекопитающих
Условия гибернации
2.2 Методы исследования
Определение активности АХЭ
Определение концентрационной зависимости активности АХЭ
Определение кинетических характеристик АХЭ
Тепловая денатурация АХЭ
Анализ кинетических кривых термоденатурации АХЭ
Определение содержания белка
2.3 Статистический анализ данных
ГЛАВА III
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Концентрационная зависимость активности АХЭ синаптических мембран мозга крыс
3.2. Термоденатурция АХЭ синаптических мембран мозга крыс
3.3. Влияние гипотермии на термостабильность АХЭ синаптических мембран мозга крыс
3.4. Термостабильность АХЭ синаптических мембран мозга сусликов при зимней спячке
Заключение
Выводы
Список литературы

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность. Ацетилхолинэстераза - фермент выполняющий важную функцию в нервной системе млекопитающих. Он непосредственно участвует в передаче информации между нервными клетками, а также своей активностью влияет на взаимодействие удалённых друг от друга нейронов. При изменении физиологических условий в мозге, например, при гипотермии, ишемии или гипоксии активность фермента изменяется [ТекиПсз е! а!., 1999; Бип е! а1., 2007; Х1е Щ а!., 2011]. Эти изменения могут отражать как проявление процессов адаптации к новым условиям, так и патологические процессы, вызванные действием экстремального фактора. Выяснение механизмов изменений активности этого важного физиологического фермента при различных физиологических состояниях является актуальной проблемой молекулярной физиологии. Обычно для оценки того что происходит в клетках ткани при изменениях физиологических процессов измеряют активности соответствующих ферментов, обеспечивающих данный физиологический процесс. Однако, чаще всего этой информации бывает недостаточно для получения ясной картины происходящего. Измерение кинетических и термодинамических характеристик ферментов может дать ценную информацию для выяснения сложных механизмов ответной реакции клеток на изменение состояния клеток. В настоящей работе исследованы кинетические характеристики, а также кинетика тепловой денатурации ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга крыс при общей гипотермии. Исследована также тепловая денатурация ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга сусликов в динамике зимней спячки.
Цели и задачи. Целью данной работы было выяснение изменений кинетических характеристик ацетилхолинэстеразы синаптических мембран

мозга крыс и сусликов при гипотермических состояниях. Для этого были поставлены следующие задачи:
1. исследовать концентрационные зависимости активности фермента из мозга крьтс при различных искусственно созданных гипотермических состояниях,
2. исследовать кинетику тепловой денатурации фермента при различных гипотермических состояниях,
3. исследовать влияние глицерина на термоденатурацию ацетилхолинэстера-зы из мозга крыс,
4. исследовать тепловую денатурацию ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга сусликов при зимней спячке.
Положения, выносимые на защиту.
1. кинетические характеристики активность ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга крыс при гипотермических состояниях изменяются: максимальная скорость и константа Михаэлиса увеличиваются
2. кинетика термоденатурации ацетилхолинэстеразы из мозга крыс и из мозга сусликов имеет две стадии - быструю и медленную - и хорошо соответствует модели двух экспонент
3. термостабильность ацетилхолинэстеразы из мозга крыс при гипотермических состояниях уменьшается: константы скорости денатурации увеличиваются
4. активность ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга сусликов в состоянии глубокой спячки увеличивается по сравнению с летним контролем, а при межбаутном пробуждении уменьшается по сравнению с летним контролем
5. термостабильность ацетилхолинэстеразы мембран мозга сусликов как в бауте глубокой спячки, так и при межбаутном пробуждении выше, чем в летнем контроле: константы скорости денатурации уменьшаются, энергии активации увеличиваются.

периферическом месте блокирует выход продукта (холина) из каталитического ущелья, то скорость реакции снизится.
Согласно простейшей модели субстратного ингибирования [82е§1е1еБ е! а1., 1999] с одним ингибиторным местом связывания:
E + S ES

Е + Р
к_з "Î k3s SES

где SES - непродуктивный комплекс
кз - константа скорости образования комплекса SES к_з - константа скорости диссоциации комплекса SES
Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата описывается уравнением Холдейна

V=—(1) Km + S+Y
где V - скорость реакции; 8 - концентрация субстрата; Ут - максимальная скорость; к арр - кажущаяся константа Михаэлиса; к55 - константа субстратного ингибирования (величина, характеризующая сродство субстрата к ингибиторному месту).