Влияние фосфорилирования на структуру и шапероноподобную активность малого белка теплового шока человека Hsp22

• Автор: Шеметов, Антон Александрович
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 111 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Список использованных сокращений

Введение

I. Обзор литературы

1. Структура малых белков теплового шока

Суперсемейство вНэр

Структура мономеров малых белков теплового шока

Олигомерная структура малых белков теплового шока

Образование гетероолигомерных комплексов малыми белками теплового шока

2. Функции малых белков теплового шока

2.1. Шаперонная активность

2.1.1. Взаимодействие малых белков теплового шока с бслками-субстратамп
2.1.2. Взаимодействие вИйр с шаперонной системой клетки
2.2. Участие малых белков теплового шока в протеолитической деградации частично денатурированных белков
2.3. Участие малых белков теплового шока в апоптозе и канцерогенезе
3. Регуляция активности малых белков теплового шока
II. Материалы и методы
Препаративные методы
1.1. Экспрессия генов точечных мутантов рекомбинантного Нзр
1.2. Получение компетентных клеток
Получение клеток, компетентных для химической трансформации
Получение клеток, компетентных для электропорации
1.3. Выделение рекомбинантного Нзр
2. Фосфорилирование №р22 и его точечных мутантов под действием цАМФ-зависимой иротеинкиназой
3. Фосфорилирование Н.чр22 и его точечных мутантов под действием протеинкиназы ЕЯК
4. Флуоресцентная спектроскопия
5. Спектроскопия кругового дихроизма
6. Метод ограниченного протеолиза
7. Аналитическое ультрацентрифугирование
8. Гель-фильтрация
9. Химическое «сшивание» при помощи диметилсуберимидата
10. Химическое «сшивание» при помощи глутарового альдегида
11. Определение шаперонной активности
11.1. Определение шаперонной активности с инсулином
11.2. Определение шаперонной активности с роданазой

Аналитические методы
Электрофорез в полиакриламидном геле
БЭБ-электрофорез
Электрофорез в нативных условиях
Изоэлектрофокусирование
Окрашивание полиакриламидных гелей серебром
Авторадиография
Спектрофотометрическое определение концентрации белка
III. Результаты п обсуждение
1. Экспрессия генов рекомбинантного Нзр22 в клетках Е.соИ
2. Выделение рекомбинантного Нзр
3. Фосфорилирование 11вр22 и его точечных мутантов под действием цАМФ-зависимой протеинкиназы
4. Фосфорилирование Нвр22 и его точечных мутантов под действием протеинкиназы ЕЮС
5. Влияние фосфорилирования и мутаций, имитирующих фосфорилирование, на структуру Шр
5.1. Влияние фосфорилирования и мутаций, имитирующих фосфорилирование, на вторичную структуру Нвр
5.2. Влияние фосфорилирования на третичную структуру Няр
5.2.1. Изучение собственной триптофановой флуоресценции
5.2.2. Ограниченный протеолиз
5.3. Влияние фосфорилирования на четвертичную структуру Нвр
5.3.1. Химическое «сшивание» при помощи диметилсуберимидата и глутарового
альдегида
5.3.2. Гель-фильтрация
5.3.3. Аналитическое ультрацентрифугирование
6. Шапероноподобная активность Нзр
6.1. Шапероноподобная активность №р22 с использованием инсулина в качестве модельного белка-субстрата
6.2. Шапероноподобная активность с использованием роданазы в качестве модельного белка-субстрата
Заключение
Выводы
Список литературы

Список использованных сокращений
АТФ аденозинтрифосфат
бис-АНС бис-1,8-анилинонафталинсульфонат
ГА глутаровый альдегид
дмс дйметилсуберимидат
дсн додецилсульфат натрия
дтт дитиотрейтол
кд круговой дихроизм
мРНК матричная РНК
мэ Р-меркаптоэтанол
ПААГ полиакриламидный гель
ПКА протеинкиназа А
ПСА персульфат аммония
РНК рибонуклеиновая кислота
ТЕМЕД N,14,№ ,14 ’ -тетраметилэтилендиамин
ірис Трис-гидроксиметиламинометан
ФМСФ фенилметилсульфонилфторид
цАМФ циклический аденозинмонофосфат
цГМФ циклический гуанозинмонофосфат
ЭДТА этилендиаминтетраацетат
ЯМР ядерный магнитный резонанс
ERK1 киназа, активируемая внеклеточными сигналами (Extracellular signal-Regulated Kinase 1)
HEPES Н-2-гидроксиэтилпиперазин4М'-2-этансульфоновая кислота
ІСР10 рибонуклеотид редуктаза вируса герпеса
IPTG изопропилтио-Р-О-галактозид
МКВР белок-активатор протеинкиназы, характерной для скелетных мышц с миотонической дистрофией (myotonic dystrophy protein kinase binding protein)
МАРК митоген-активируемая протеинкиназа (mitogen-activated protein kinase)
МАРКАРК протеинкиназа, активируемая митоген-активируемой протеинкиназой (mitogen-activated protein kinase activated protein kinase)
МЕК киназа MAP и ERK киназ (Mitogen-activated protein kinase kinase, MAP kinase/ERK kinase)
LB среда Луриа-Бертани
Hsp белок теплового шока (heat shock protein)
ODFP белок-1 наружных плотных фибрилл сперматозоидов (outer dense fiber protein-1)
S1 субфрагмент 1 миозина, получаемый при расщеплении миозина химотрипсином в присутствии ЭДТА

увеличению размеров олигомерных комплексов, и именно очень крупные олигомеры обладают повышенной шаперонной активностью. Таким образом, несмотря на противоречивость представленных данных, можно заключить, что изменение олигомерного состава малых белков теплового шока может влиять на их шаперонную активность. Отсюда следует вывод о том, что различные воздействия, приводящие в изменению олигомерного состояния малых белков теплового шока, будут оказывать существенное влияние на его шаперонную активность.
Важным механизмом регуляции активности малых белков теплового шока является фосфорилирование. Оно является широко распространенным видом посттрасляционной модификации sHsp и, как правило, сопровождается изменением олигомерного состояния и шаперонной активности малых белков теплового шока (73).
Данные литературы свидетельствуют о том, что практически все малые белки теплового шока могут подвергаться фосфорилированию. При этом любопытно отметить, что почти всегда участки фосфорилирования располагаются в вариабельном N-концевом домене. Установлено, что аВ-кристаллин может фосфоршгароваться под действием р44/42 MAP-киназы (Erkl/2) (Ser45), под действием МАРКАР2-киназы (Ser59), а также, по-виднмому, под действием цАМФ-зависимой протеинкиназы (Ser19) (92).
Фосфорилирование аВ-кристаллина сопровождается уменьшением размеров крупных олигомеров, образованных этим белком (83).
Hsp20 может фосфорилироваться в условиях in vitro и in vivo под действием цАМФ- и цГМФ-зависимых протеинкиназ по Ser16, расположенному в N-концевой области белка (11). При этом фосфорилирование Hsp20 каким-то до сих пор не до конца понятным образом способствует расслаблению гладкой мускулатуры (22, 51, 62, 156).
Показано, что Hsp25 мыши фосфорилируется in vivo неизвестными эндогенными протеинкиназами, a in vitro цАМФ-зависимой протеинкиназоп и протеинкиназой С по одним и тем же участкам, а именно по Ser15 и Ser86 (63). В случае Hsp27 человека МАРКАР 2/3 фосфорилирует Serls, Ser78 и Ser82, при этом в условиях in vitro наибольшее количество фосфата переносится на Ser82 (105). Hsp27 может быть фосфорилирован также под действием цГМФ-зависимой протеинкиназы (26, 99). Следует заметить, что фосфорилирование под действием МАРКАР-киназ приводит к диссоциации крупных олигомеров Hsp27 с образованием ди- или тетрамеров и значительным изменением шаперонной активности. В полном согласии с этими данными было установлено, что мутации Hsp25 птиц (гомолога Hsp27 человека), имитирующие фосфорилирование (мутации S15,77,81D), сопровождаются диссоциацией олигомеров Hsp25. Любопытно отметить, что указанные мутации приводят, с одной стороны к увеличению шаперонной