Функционирование, механизм регуляции активности и возможное практическое использование голубых медьсодержащих оксидаз

• Автор: Шлеев, Сергей Валерьевич
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 322 с. : ил.

Оглавление
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Общий план строения, свойства и каталитический механизм действия
ГОЛУБЫХ МЕДЬСОДЕРЖАЩИХ ОКСИДАЗ
1.2. Факторы, определяющие редокс-потенциал медных центров голубых МЕДЬСОДЕРЖАЩИХ ОКСИДАЗ
1.3. Аскорбатоксидаза
1.4. Билирубиноксидаза
1.5. Церулоплазмин
1.6. Лакказа
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы и объекты исследования
2.2. Выделение и очистка ферментов 85 ■
2.3. Определение биохимических характеристик лакказ
2:4. Спектральные исследования
2.5. Электрохимические исследования
2.6. Исследования медиаторов лакказ
2.7. Ферментативный синтез полианилина
2.8. Квантово- и молекулярно-механические расчеты
энергий реорганизации медных ЦЕНТРОВ ОКСИДАЗ
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ
3.1. Выделениеи ОСНОВНЫЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЛАККАЗ
3.2. Медиаторы—усилители действия лакказ
3.3. Выделениеи основные физико-химические свойства лакказ Тиакштез РЦВЕЗСЕ№
3.4. Сравнение биокаталитических характеристик высоко и низко редокс-
ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ЛАККАЗ
3.5. Бактериальная голубая медьсодержащая оксидаза
3.6. Ферментативный синтез полианилина
3.7. Комплексное сравнительное электрохимическое
изучение медьсодержащих оксидаз
3.8. Разработка амперометричесих биосенсоров первого и второго рода для определения ЛИТВИНОВ и фенольных соединений

3.9. Разработка безмедиаторных биокатодов
И МОДЕЛЕЙ БИОТОПЛИВНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ГЛАВА 5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Список сокращений
ABTS - диаммониевая соль 2,2’-азино-бис-(3-этилбензтиазолин-б-сульфоната)
Ag/AgCl — хлорсеребряный электрод
АОх - аскорбатоксидаза
МСО - голубые медьсодержащие оксидазы
ВОх - билирубиноксидаза
CDH - целлобиозодегидрогеназа
Ср — церулоплазмин
НАВА - 3-(6-гидрокси)-аминобензойная кислота НВТ - 1-гидроксибензотриазол HPI - N-гидроксифталеимид
HPLC - высокоэффективная жидкостная хроматография HQ - гидрохинон Lc - лакказа
LiP - лигнинпероксидаза
LMS - лакказа-медиаторная система
МпР — марганецпероксидаза
NHE — нормальный водородный электрод
pi — изоэлектрическая точка
РР - 1-фенил-3-метил-пиразолон-
РРА — 1-фенил-(2,3-диметил-4-амино-пиразолон-5)
PPA-Na - 1-фенил-2,3-диметил—4-аминопиразолон-5п- метансульфонат натрия
SDS - додецилсульфат натрия
SPGE — электрод из спектрального графита
mSPP - 1-(3'-сульфофенил-3-метил-пиразолон-5)
pSPP — 1-(4'-сульфофенил-3-метил-пиразолон-5)
TEMPO - 2,2,6,б-тетраметил-(1- пиперидинилоксил)
VA — вератровый спирт (3,4-диметоксибензиловый спирт)
ВЭП - внутримолекулярный электронный перенос ИЭФ - изоэлектрофокусирование

67 кДа (две из них с pi 4.7 и одна с pi 2.9), две изоформы (POXAlb и POXAlw) - 61 кДа (pi 6.7 - 6.9), в то время как две другие (РОХАЗа и РОХАЗЬ) представляют собой гетеродимеры (pi 4.1 - 4.3), состоящие из двух субъединиц - большой (61 кДа) и маленькой (16 или 18 кДа). Несмотря на'то, что Lc РОХС является доминирующей внутри и внеклеточной формой, более высокий синтез мРНК был обнаружен у формы POXAlb, которая является в основном внутриклеточным или связанным с клеточной стенкой белком. Образование субъединичных изоферментов Pleurotus ostreatus индуцируется ионами меди в культуральной среде [Palmieri et al., 2000; 2003].
Гриб Т. villosa продуцирует три формы Lc с молекулярной массой 63 кДа и с pi 3.5, 6-6.5 и 5-6 [Yaver et al., 1996], C. subvermispora - четыре формы фермента (68-71 кДа, с pi от 3.4 до 4.7) [Fukushima and Kirk, 1995], плоский трутовик G. lucidum пять форм Lc с pi 3, 4.25, 4.5, 4.8, 5.1 и молекулярными массами 40 - 66 кДа [Kumari and Sirsi, 1972; Ко et al., 2001]. Множественность форм Lc связана, по-видимому, с разнообразием процессов, в которых принимает участие фермент - синтез/деградация лигнина, образование плодовых тел, гумификация органических остатков, образование пигментов, детоксификация ксенобиотиков и других [Колобова с соавт., 2002].
Количество форм фермента зависит от условий культивирования. Присутствие индукторов в среде может приводить к образованию различных изоформ фермента [Galhaup and Haltrich, 2001; Souza de et al., 2004]. Гриб P. pulmonarius продуцирует три. изоформы Lc, две из которых (lccl и 1сс2) являются конститутивными, а изоформа 1ссЗ обнаруживается только при выращивании гриба в присутствии индукторов [Souza de et al., 2004].
Хотя большинство грибных Lc являются мономерными белками, в литературе описаны ферменты, состоящие из нескольких субъединиц. Например, Lc из дереворазрушающих грибов Phellinus ribis [Min et al., 2001], P. pulmonarius [Souza de and Peralta, 2003] и T. villosa [Yaver et al., 1996], из микоризных грибов Cantharellus