Специфический анионный транспортер церебральных эндотелиоцитов : получение моноклональных антител, исследование органной и клеточной локализации и нейрокогнитивных функций

• Автор: Кардашова, Карина Шамилевна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 181 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ТРАНСПОРТНЫЕ СИСТЕМЫ ЦЕНТРАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ

Транспорт через гсматоэнцефалический и гематоликвирный барьеры

Пассивная диффузия

Транспор с помощью носителя (транспортер-опосредованный перенос)

Эндоцитоз

Активный транспорт

Функциональная экспрессия транспортеров на сайтах гематоэнцефалического барьера

Семейство ABC-транспортеров

Р-гликопротеин
Белок BCRP / Всгр
Белки множественной лекарственной устойчивости (MRPs / Mrps)
Суперсемейство SLC транспортеров
Транспортеры органических анионов О A Ts / Oats
Транспортеры органических катионов OCTs / Octs
Транспортеры органических анионных полипептидов О A TPs / Oatps
BSAT1 (blood-brain barrier-specific anion transporter 1)
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Характеристика исследуемого материала
Животные
Культуры клеток
Культура клеток миеломы мышей линии Balb/C Sp2/0-Agl
Культура клеток глиомы С6 крысы
Получение первичной культуры церебральных эндотелиоцитов крысы
Получение первичной культуры астроцитов неонатального мозга крысы
Получение первичной культуры эндотелиоцитов пуповины человека (HUVEC)
Подготовка субстрата для культивирования эндотелиальных клеток
Совместное культивирование эндотелиоцитов с астроцитами
Создание гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к BSAT1, получение
моноклональных антител и их характеристика
Получение препарата рекомбинантного антигена BSAT
Получение моноклональных антител к BSAT1 и их характеристика
Проведение иммунизации
Процедура слияния

Подготовка клеток фидерного слоя
Процедура клонирования гибридом
Замораживание и хранение гибридом
Получение асцитов и очистка моноклональных антител
Определение класса иммуноглобулинов моноклональных антител
Методы иммунохимического анализа
Иммуноферментный анализ
Иммуноморфологический анализ
Иммунофлюоресцентный анализ
Иммуноцитохимический анализ
Иммуногистохимический анализ
Конъюгация антител с флуорофором
Конъюгация антител I
Методы количественного определения белка
Приготовление наногелей, конъюгированных с iiHmu-liSATl-антителамн
Исследование когнитивных функций у крыс
Тест распознавания нового объекта
Тест спонтанного чередования
Тест пассивного избегания
Приподнятый крестообразный лабиринт
Тестирование в лабиринте Морриса
Моделирование интракраниальной глиомы
Статистическая обработка полученных результатов
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
ГЛАВА 3. Получение моноклональных антител к рекомбинантному экстраклеточному домену специфического транспортера органических анионов церебральных эндотелиоци-
тов и изучение их иммунохимических свойств
ГЛАВА 4. Иммуноморфологический анализ органной, тканевой и клеточной локализации

ГЛАВА 5. Изучение влияния анти-BSAT 1-антител на когнитивные функции беременных крыс и их потомства
ГЛАВА 6. Исследование распределения меченных I125 и AlexaFluor® 660 анти-BSATl-антител in vivo и оценка перспектив применения моноклональных антител для селективной доставки контейнерных систем экспериментальную глиому 101/
ГЛАВА 7. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В ДИССЕРТАЦИИ:
BSAT1 - цереброспецифический анионный транспортер (brain specific anion transporter 1)
C6 - линия крысиной глиомы С6 Сх-43 - коннексин
DAPI - флуоресцентный ядерный краситель 4',6-диамидино-2-фенилиндол Dil — флуоресцентный краситель 1,Г-октадецил 3,3,3’,3-тетраметилиндокарбоцианин перхлорат
PCS - fetal calf serum (фетальная сыворотка телёнка)
GFAP - глиофибриллярный кислый протеин
GFP - green fluorescent protein (зеленый флюоресцентный белок)
GLUT1 - переносчик глюкозы-
НЕК293 - линия человеческой эмбриональной почки
HUVEC - линия человеческих эндотелиоцитов из пупочной вены
ICAM-I - межклеточный белок клеточной адгезии (intercellular cell adhesion molecule)
IgG - иммуноглобулины G IL - интерлейкин
JAM - контактные адгезивные молекулы (junctional adhesive molecules)
LAT1 - переносчик крупных аминокислот (large amino acid transporter)
MCT - переносчик монокарбоксильных соединений
MRP - белок мультилекарственной резистентности (multidrug resistance-associated protein) OATP - переносчик органических анионов OD - оптическая плотность PBS - фосфатно-солевой буфер
PFS6 — выживаемость в течение 6 месяцев без прогрессии
Pgp - Р-гликоиротсин
SDS - додецил-сульфатнатрия
ТМВ - 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (3,3',5,5'-tetramelhyl benzidine)
TNF-a - фактор некроза опухоли-альфа VCAM-1 - сосудистый белок клеточной адгезии-1 VE-cadherin- васкулярно-эндотелиальный кадгерин
VEGF- эндотелиальный фактор роста (vascular endothelial cell adhesion molecule)
a.o. - аминокислотные остатки
АГ - антиген
AC - антисыворотка
AT — антитела
БСА - бычий сывороточный альбумин
ГГФРТ - гипоксантин-гуанин-фосфюрибозилтрансфераза

специфичностью и участвует во всасывании, распределении и экскреции ксенобиотиков (таблица 1.2.).
Таблица 1.2. Локализация членов семейства ОАТР в Ц1ІС и их субстраты
Изоформы ОЛТР Локализация в ЦНС Субстраты
Грызуны
СЫрЫ (э1со1а1) Сосудистое сплетение ВС>123, ВБРТЖР-БО, холаты, кортизол, СЯС220, дел-торфин II. ОРЭРЕ, эналаприл, эстрадиола-17 Р-глюкуронида, эстрон-3-сульфат, фексофенадин. гадоксе-тат, глутатион, глюкохолат, урсодеоксихолевая кислота, охратоксип а, уабаин, правастатин, Б-динитрофенил, сульфат тауролитохолевой кислоты, тауродезоксихоле-вая кислота(ТСОСА), тауроксенодинхолат натрия(ТІЮСА), таурохолевая кислота, темокаприлат
СЫр1а4 (з1со1а4) ГЭБ сосудистое сплетение BQ123, холаты, дегидроэпиандростерон-сульфат (ОНЕАБ), дигоксин, ОРЭРЕ, эстрадиола-17 |3-глюкуронид, эстрон-3-сульфат, фексофенадин, гликохо-лат, уабаин, правастатин, таурохолат, ТЗ, Т4, ТСОСА, ТШСА
Оа1р1а5 (5Ісо1а5) Сосудистое сплетение Бромсульфофталин, В<3123, холаты, кортизол, дексаме-тазон, БНЕАБ, эстрадиола-17 Р-глгокуронида, эстрон-3-сульфат, гликохенодезоксихолиевая кислота, гликохо-лат, гликодезоксихолат, СУ4064, олеиновая кислоты, простогландин Е2, ТЗ, Т4, тауродезоксихолат, таурохолат, ТСОСА, ТГЮСА, урсодезоксихолевая кислота
СЫр1с1 (бісоісі) ГЭБ сосудистое сплетение Эстрадиола-17 и б-глюкоронид, церивастатин, обратный ТЗ, Т4, сульфат троглитазона
ОаІр2аІ (зс1о2а1) ГЭБ Простагландин Е
Человек
ОАТР1А2 (8ГСОІА2) ГЭБ ОРОРЕ, эстрон-3-сульфат, фексофенадин, гатифлокса-цин, глнкохолат, гидроксимочсвина, иматиниб, лабета-лол, левофлоксацин, ломефлоксацин, лопинавир. мези-лат, микроциклин- ЬЯ, N -метилхинин, N, мстилхини-дин, норфлоксацин, уабаин, питавастигин, простогландин Е2, соталол, рокурониум, розувастатин, обратный