Молекулярные механизмы регуляции продукции оксида азота в эпителиальных клетках мочевого пузыря лягушки

• Автор: Николаева, Светлана Дмитриевна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 154 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Физиологическая роль оксида азота

1.2. Биосинтез оксида азота

1.3. Функциональная роль N0 в регуляции транспорта воды в собирательных

трубках почки млекопитающих и мочевом пузыре амфибий

1.4. Участие NO в неспецифическом иммунном ответе в уроэпителии и почке млекопитающих

1.5. Регуляция активности разных изоформ NOS

1.5.1. Регуляция конститутивных NOS
Кальций/кальмодулин
Эндогенные ингибиторы NOS
Фосфорилирование
Миристоилирование и пальмитоилирование
Регуляция экспрессии eNOS и nNOS
1.5.2. Механизмы регуляции iNOS
1.5.2.1. Механизм действия ЛИС на экспрессию iNOS
1.5.2.2. Роль циклооксигеназы и простагландинов в индукции экспрессии iNOS
1.5.3. Регуляция продукции NO за счет изменения доступности субстрата
1.5.3.1. Транспорт аргинина
1.5.3.2. Аргиназа
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Животные
2.2.Получение суспензии клеток мукозного эпителия мочевого пузыря лягушки
2.3. Получение первичной культуры клеток мукозного эпителия мочевого пузыря лягушки
2.4. Определение концентрации нитритов в культуральной среде
2.5. Исследование активности NO-синтазы в гомогенате эпителиальных клеток
мочевого пузыря лягушки
2.6. Определение активности NOS и аргиназы в суспензии изолированных эпителиальных клеток
2.7. Определение параметров транспорта Z-аргинина
2.8. Измерение активности аргиназы в гомогенатах тканей и клеток
2.9. Измерение концентрации белка в лизате эпителиальных клеток
2.10. Выделение РНК из эпителиальных клеток мочевого пузыря лягушки
2.11. Обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР)
2.12. Электрофорез РНК и ДНК в агарозном геле
2.13. Иммуноблоттинг
2.13.1. Приготовление проб для электрофоретического разделения
2.13.2. Электрофорез белков в полиакриламидном геле
2.13.3. Иммуноблоттинг со специфичными антителами
2.14. Выделение лейкоцитов из крови лягушки и крысы
2.15. Получение перитонеальных макрофагов крысы
2.16. Статистическая обработка результатов
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. NO-синтазы в эпителиальных клетках мочевого пузыря лягушки
3.1.1. Обнаружение NO-синтазной активности в изолированных клетках
3.1.2. Идентификация изоформ NOS
3.1.2.1 .Исследование кальциевой зависимости NOS в клеточных гомогенатах
3.1.2.2. Влияние селективных ингибиторов конститутивных и индуцибельной NOS на NO-синтазную активность в эпителиальных клетках
3.1.2.3. Идентификация изоформ NOS в эпителии мочевого пузыря лягушки методом иммуноблоттинга
3.1.2.4. Идентификация iNOS методами ОТ-ПЦР и сиквенирования. Частичная характеристика первичной структуры iNOS
3.2 Регуляция продукции NO изменением экспрессии iNOS в эпителиальных
клетках
3.2.1. Влияние бактериального эндотоксина ЛИС E. coli на продукцию нитритов изолированными эпителиальными клетками
3.2.2,Обнаружение рецептора ТІ_Л14 в эпителиальных клетках мочевого пузыря
3.2.3. Оценка вклада фагоцитирующих клеток в эффект ЛПС на продукцию
нитритов
3.2.4. Изменение экспрессии мРНК и белка iNOS под действием ЛПС Е
3.3. Роль циклооксигеназы и простагландинов в регуляции экспрессии iNOS
3.4. Механизмы регуляции продукции NO на уровне доступности субстрата
3.4.1. Транспорт аргинина в клетках эпителия мочевого пузыря лягушки
3.4.1.1. Характеристика транспортера катионных аминокислот в
эпителиальных клетках мочевого пузыря лягушки
3.4.1.2. Влияние ЛПС Е. coli иа вход аргинина в клетки
3.4.2. Участие аргиназы в регуляции продукции NO
3.4.2.1. Активность аргиназы в эпителиальных клетках и ее кинетические характеристики
3.4.2.2. Идентификация изоформы аргиназы, присутствующей в
эпителиальных клетках
3.4.2.3. Активность NOS в условиях ингибирования аргиназы
3.4.2.4. Конкурентные отношения NOS и аргиназы в присутствии ЛПС
3.4.2.5. Влияние ЛПС на активность и экспрессию аргиназы
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
Список используемой литературы

l! I І?"
>0 fo 1-0 fo

Outer
I Phospholipid» I
Рис. 4. Структура мембраны грамотрицательных бактерий (рис. из /Raetz, Whitfield, 2002]).
сигнала внутри клетки происходит при участии большого количества адапторных белков, таких как MyD88 (myeloid differentiation factor 88), MAL (MyD88 adaptor-like protein), TRIF (TIR-containing adaptor inducing IFNP), TRAM (TRIF-related adaptor molecule). Активации TLR4 может приводить к инициации как Му088-зависимого, так и Му088-независимого путей передачи сигнала. Взаимодействие TLR4 с белком MyD88 активирует серин/треониновую киназу IRAKI (IL-1 receptor-associated kinase 1) и ее связывание с TRAF6, что приводит к активации двух сигнальных путей, включающих в себя протеинкиназы РІЗК/Akt и ТАКІ (TGF-activated kinase 1), стимулирующих высвобождение транскрипционного фактора NF-kB, регулирующего транскрипцию ряда генов [см. обзор Dauphinee, Karsan, 2006].
Показано, что активация рецептора ЛПС может приводить к усилению экспрессии генов и независимо от MyD88. Передача сигнала, не