Создание высокоаффинных гетеродимерных фотоаптамерных конструкций к тромбину

• Автор: Рахметова, Светлана Юрьевна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 132 с. : ил.

Оглавление

Список сокращений

Введение

Цель и задачи исследования

Научная новизна работы

Практическая значимость исследований

Апробация работы

Структура и объем диссертации

1 Обзор литературы

1.1 Аптамеры. Методы получения и области применения

1.1.1 Методы получения аптамеров
1.1.2 Особенности структуры аптамеров и их взаимодействия с белками-мишенями
1.1.3 Аптамеры как терапевтические средства
1.1.4 Аптамеры как аффинные реагенты для аналитических целей
1.2 Фотоаптамеры
1.2.1 Фотоиндуцированные ковалентные связи между белком и галогеносодержащими нуклеиновыми кислотами
1.2.2 Получение и использование фотоаптамеров
1.2.3 Фотохимические реакции в ДНК с участием галоген-урацилов
1.3 Тромбин и антитромбиновые аптамеры
1.4 Молекулярные аптамерные конструкции
1.5 Исследование межмолекулярных взаимодействий методом поверхностного плазмонного резонанса
1.5.1 Эффект поверхностного плазмонного резонанса (ППР) и его использование в оптических биосенсорах
1.5.2 Получение кинетических и равновесных констант молекулярных взаимодействий методом ППР
2 Материалы и методы
2.1 Реагенты и растворы

2.2 Синтез и очистка олигонуклеотидов
2.3 Масс-спектрометрический анализ
2.4 Измерение аффинности антитромбиновых аптамеров и их димерных конструкций на оптическом биосенсоре ЕНасоге 3
2.5 Облучение комплексов фотоаптамер/тромбин
2.6 Электрофоретический анализ облучённых комплексов фотоаптамер/тромбин
2.7 Трипсинолиз белка в ковалентном комплексе с фотоаптамером
3 Результаты и обсуждение
3.1 Димерные конструкции антитромбиновых аптамеров
3.1.1 Выбор пары аптамеров и создание димерных конструкций
3.1.2 Исследование аффинности гомо- и гетеродимерных конструкций антитромбиновых аптамеров
3.1.3 Селективность гетеродимерных конструкций антитромбиновых аптамеров
3.2 Оценка термодинамических параметров взаимодействия тромбина с антитромбиновыми аптамерами и их гетеродимерной конструкцией..
3.3 Антитромбиновые фотоаптамерные гетеродимерные конструкции
3.3.1 Йод- и бром-урацил-содержашие антитромбиновые фотоаптамеры
3.3.2 Фотоиндуцированные ковалентные комплексы тромбина с антитромбиновыми фотоаптамерными гетеродимерными конструкциями
3.3.3 Сравнительный анализ выхода ковалентных комплексов с тромбином для фотоаптамеров и фотоаптамерных конструкций
3.3.4 Формирования фотосшивок между тромбином и фотоаптамерными конструкциями в присутствии других белков
3.3.5 Фотоинактивация антитромбиновых фотоаптамеров и фотоаптамерных конструкций под воздействием ультрафиолетового излучения
4 Заключение
5 Выводы
6 Список литературы

Список сокращений
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
РНК - рибонуклеиновая кислота
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
HEPES — К-(2-гидроксиэтил)пиперап-Н-этан сульфоновая кислота
ДДТ - дитиотриитол
ЯМР - ядерно-магнитный резонанс
БСА - бычий сывороточный альбумин
ПНР - поверхностный плазмонный резонанс
SELEX - (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) -систематическая эволюция лигандов экспоненциальным обогащением siRNA - малые интерферирующие РНК mAb - моноклональные антитела Fab - фрагмент антитела
ПААТ — полиакриламидный гельэлектрофорез
IC50 — концентрация ингибитора, при которой активность фермента составляет 50% от исходной

нуклеотидных последовательностей, является так называемая «тирания коротких мотивов» («tyranny of short motives» (152)). Более короткие олигонуклеотиды, формирующие пространственные структуры с умеренной аффинностью к белку-мишени, могут «выиграть» при отборе в силу их большей относительной представленности. Другая проблема состоит в том, что ПЦР, которая является составной частью SELEX, может «смещать» выбираемую популяцию олигонуклеотидных последовательностей от оптимума по аффинности в сторону оптимального соотношения аффинности и «репликативности» (152). В случае селекции фотоаптамеров, где отбор ведётся по двум параметрам — аффинности и эффективности формирования фотосшивок (69), наиболее аффинные последовательности могут теряться в силу «компромисса» между двумя параметрами отбора.
Идея, лежащая в основе «инженерного» подхода к повышению аффинности, состоит в том, что возможность одновременного взаимодействия двух и более сайтов лиганда с двумя и более сайтами, мишени приводит к образованию более стабильного комплекса. Этот эффект хорошо известен для низкомолекулярных лигандов (так называемый «chelate effect») (15). Известны успешные попытки его реализации и в случае макромолекулярных лигандов, таких как рекомбинантные фрагменты антител, объединённые в димерные и тримерные конструкции методами генной инженерии (110; 227).
Применительно к аптамерам, к настоящему времени апробированы три подхода к созданию молекулярных конструкций. В первом случае, аптамеры соединяются посредством гибких линкеров как нуклеотидной (80; 142; 212), так и ненуклеотидной (43; 122; 107; 176; 206) природы. В качестве основы гибких линкеров ненуклеотидной природы использовали либо молекулу глицерина (43; 122), либо этиленгликоля (43; 107; 176; 206). Это, скорее всего, определено возможностью связать две нуклеотидные последовательности такими линкерами в процессе химического синтеза,