Атомно-силовые чипы для выявления маркеров заболеваний вирусными гепатитами B и C

• Автор: Французов, Павел Александрович
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 104 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Вирус гепатита В

1.2. Лабораторная диагностика вирусного гепатита В

1.3. Вирус гепатита С

1.4. Лабораторная диагностика вирусного гепатита С

1.5. Основы метода ACM

1.6. Колебательные методики ACM

1.7. Примеры применения ACM для исследования

биологических объектов

1.8. Способы иммобилизации биологических макромолекул

на подложки ACM
Глава 2. АППАРАТУРА И МЕТОДИКИ
ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Использованные реактивы
2.2. Характеристика исследуемых биологических объектов
2.3. ACM Solver Р47Н и зондовая нанолаборатория NTEGRA
2.4. Получение АСМ-изображений
2.5. Обработка АСМ-изображений
2.6. Методика модификации подложки ACM
2.7. Методика приготовления образцов
2.7.1. Нековалентная иммобилизация белков на подложки ACM
2.7.2. Ковалентная иммобилизация моноклональных антител
2.7.3. Получение комплексов HBsAg с антителами против него
на поверхности АСМ-чипа
2.7.4. Получение комплексов HCVcoreAg с антителами против
него на поверхности АСМ-чипа
2.7.5. Фишинг HBsAg и HCVcoreAg из сывороток крови людей
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Выявление маркера вирусного гепатита С
3.1.1. Иммобилизация моноклональных антител против
HCVcoreAg на подложку АСМ
3.1.2. Детекция НСУсогеА§ в растворе
3.1.3. Детекция HCVcoreAg в сыворотках крови людей
3.1.4. Анализ сывороток крови на содержание HCVcoreAg с
помощью АСМ-чипов
3.2. Выявление маркера вирусного гепатита В
3.2.1. Иммобилизация моноклональных антител против HBsAg
на подложку АСМ
3.2.2. Детекция HBsAg в растворе
3.2.3. Анализ сывороток крови на содержание HBsAg с
помощью АСМ-чипов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТ
БЛАГОДАРНОСТИ
ЛИТЕРАТУРА

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ACM - атомно-силовая микроскопия, атомно-силовой микроскоп;
ИФА - иммуноферментный анализ;
ПЦР - Полимеразная цепная реакция;
HBsAg - поверхностный антиген вируса гепатита В;
HCVcoreAg - кор-антиген вируса гепатита С;
МКА - моноклональные антитела;
анти-HBsAg — антитела против поверхностного антигена вируса гепатита В;
анти-HCVcoreAg - антитела против кор-антигена вируса гепатита С;
IgM - иммуноглобулины
IgG - иммуноглобулины класса G;
ВГВ - вирус гепатита В;
ВГС - вирус гепатита С;
РИА - радиоиммунный анализ;
ЭДТА - этилендиаминтетраацетат;
APTES - аминопропилтриэтоксисилан;
EDC - 1-этил-(3,3-диметил)-аминопропилкарбодиимид;
NHS - N-гидроксисукцинимид;
ФСБ-Т - фосфатно-солевой буфер, содержащий 0,5% Твина-80;
КФБ - калий-фосфатный буфер;
3HJI - зондовая нанолаборатория.

Рис. 8. Влияние радиуса кривизны иглы кантилевера на латеральное разрешение.
1 — начальное положение острия иглы, описывающей объект; 2 — конечное положение острия иглы; 3 - исследуемый объект; (I — реальный диаметр объекта; <1каж - кажущийся диаметр объекта.
Разрешение метода атомно - силовой микроскопии по высоте приближается к разрешению РСА и достигает ~0,1 нм. В связи с тем, что радиус кривизны иглы в типичных случаях составляет порядка 10-20 нм, реальные латеральные размеры изучаемых объектов, которые для белков во многих случаях составляют от 1,5-2 до 8-10 нм, регистрируются уширенными с превышением истинного значения в несколько раз [18]. В то же время информация о латеральных размерах белков имеет не меньшее значение, чем данные о высоте белковой молекулы. Так, в работах [7, 8, 73] показано для обычных зондов с радиусом кривизны Я= 10-20 нм, увеличение латеральных размеров изолированных белков, адсорбированных на подложках АСМ в условиях комнатной температуры, атмосферного давления и обычной влажности, составляет порядка 20 нм, а в ряде случаев достигает 50 нм, в зависимости от производителя этого зонда. Это приводит к существенному завышению измеряемого объема белковых молекул. Эту