Участие α-изоформ Na,K-ATPазы в активации ERK1/2 киназы в нейрональных и подобных им клетках

• Автор: Карпова, Лариса Викторовна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 144 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Список сокращений
ВВЕДЕНИЕ
1.1. Общая характеристика Na,K-ATPa3u
1.1.1. Структура Na,K-ATPa3bi
1.1.2. Каталитический цикл Na,K-ATPa3bi
1.1.3. Изоформы Na,K-ATPa3bi
1.1.4. Кардиотонические стероиды - специфические ингибиторы Na.K-АТРазы
1.2. Сигнальные каскады с участием Na,K-ATPa3bi
1.3. Участие NMDA-рецепторов в сигнальных каскадах в нейрональных клетках
1.4. Предпосылки участия NMDA-рецепторов в реализации сигнального каскада, опосредованном действием уабаина
И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
11.1. Получение суспензии гранулярных клеток из мозжечка крыс
11.2. Первичная культура гранулярных клеток мозжечка
11.3. Условия инкубации гранулярных клеток мозжечка
11.4. Культивирование клеток нейробластомы SK-N-AS
11.5. Условия инкубации клеток нейробластомы SK-N-AS
11.6. Проточная цитометрня
II.б. 1. Определение уровня свободных радикалов
II.6.2. Определение уровня внутриклеточного Са2+
Г1.6.3. Определение доли мертвых клеток в клеточной суспензии
11.6.4. Определение типа клеточной смерти
11.6.5. Определение активности Erkl/2 киназы (р42/44 МАР киназы) в клетках
11.7. Определение нуклеотидных последовательностей методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)
11.7.1. Выделение тотальной мРНК
11.7.2. Получение кДНК в реакции обратной транскрипции и полимеразная цепная реакция
11.7.3. Электрофорез в агарозном геле
11.8. Подавление биосинтеза мРНК, кодирующих а изоформы Na,K-ATPa3bi, малыми интерферирующими РНК (сиРНК)
11.8.1, Тестирование эффективности трансфекции клеток нейробластомы SK-N-AS
11.8.2. Липосомная трансфекция клеток нейробластомы SK-N-AS сиРНК
11.9. Приготовление клеточных лизатов

11.10. Определение концентрации белка
11.11. Разделение белков методом электрофореза и вестерн блоттинг
II. 11.1. Электрофорез в 8ББ-полиакриламидном геле
II. 11.2. Вестерн блоттинг
II. 11.3. Метод усиленной хемилюминесценции (ЕСЬ)
11.13. Приготовление образцов для конфокальной микроскопии
11.14. С татистическая обработка результатов
III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
111.1. Участие 1Ча,К-АТРазы в процессах клеточной сигнализации в нейрональных клетках
III. 1.1. Эффект уабаина на жизнеспособность нейрональных клеток
III. 1.2. Эффект уабаина на уровень свободных радикалов и Са2+ в нейрональных
клетках
III. 1.3. Влияние уабаина на активность Егк 1 /2 киназы в нейрональных клетках
111.1.4. Участие протеинкиназ в активации Егк1/2 киназы, вызванной действием уабаина на нейрональные клетки
111.2. Роль а изоформ 1Ча,К-АТРазы в процессах клеточной сигнализации в клетках
нейробластомы БК-1Ч-АБ
111.2.1. Определение изоферментного состава ИаД-АТРазы и субъединичного состава ЫМБА-рецепторов в клетках нейробластомы БК-М-АБ
111.2.2. Влияние уабаина на жизнеспособность клеток нейробластомы БК-М-АБ
111.2.3. Активация ключевых белков различных сигнальных каскадов в клетках
нейробластомы БК-1Ч-АБ при действии уабаина
И.2.4. Подавление биосинтеза а! и аЗ изоформ Ыа,К-АТРазы в клетках нейробластомы БК-М-АБ
111.2.5. Жизнеспособность клеток нейробластомы БК-ГГ-АБ с подавленной экспрессией а1 и аЗ изоформ Ма,К-АТРазы
111.2.6. Активация Егк 1 /2 киназы при действии уабаина на клетки нейробластомы БК-
М-АБ с подавленной экспрессией а1 и аЗ изоформ МаД-АТРазы
IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
VI. ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Список сокращений
АТФ - аденозпнтрифосфат
АФК - активные формы кислорода
БСА - бычий сывороточный альбумин
ГАФД (GAPDH) - глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа
ДМСО - диметилсульфоксид
КТС - кардиотонические стероиды
ГТААГ - полиакриламидный гель
сиРНК - малые интерферирующие РНК
ФИТЦ (FITC) - флуоресцеинизотиоцианат
ЭГТА - гликоль-бис(2-аминоэтил-эфир)-К,]Ч,1Ч',М'-тетрауксусная кислота Akt - протеинкиназа В
ВАРТА - 1,2-ди(2-акшнофенокси)этаи-1М,Т1,]ч-1,М-тетраацетат DAPI - 4',6-диамидино-2-фенилиндол DCF - дихлорфлуоресцеин
DCFH2-DA - 2,7-дихлордигидрофлуоресцеин диацетат
ECL - усиленная хемилюминесценция
EGFR - рецептор эпидерального фактора роста
Fluo-3-AM - пентаацетоксиметиловый эфир [2-амино-5-(2,7-дихлор-6-гидрокси-3-оксо-9-ксантенил)фенокси]-2-(2-амино-5-метилфенокси)этан-
N,N,N'.N'-TCTpayKcycHaM кислота FSC - прямое светорассеяние
МТТ - 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тстразолиум бромид NAC - N-ацетилцистеин NMDA - Жметил-О-аспартат
р42/44 МАР киназа (МАРК или Erk 1/2 киназа) - митоген-активируемая
протеинкиназа
PBS - фосфатный буфер
PI - йодистый пропидий

каскадов. Было показано, что активация NMDA-рецепторов приводит к дополнительном}' увеличению внутриклеточной концентрации Са2+ за счет его выхода из ЭПР (Emptage et al, 1999).
РКС, РКА, казеин киназа, Src киназы и фосфатазы, кальций/кальмодулин-зависимые киназы и фосфатазы регулирует функцию NMDA-рецепторов (MacDonald et al, 2001). Например, активация РКС, которая происходит с участием CAK(3/Src - тирозинкиназного сигнального каскада, приводит к усилению активации NMDA-рецепторов, в результате повышения количества рецепторов в синапсах. Фосфорилированпе NMDA-рецепторов РКС также приводит к повышению чувствительность рецепторов к инактивирующему действию Са2+. Известно, что участки фосфорилирования для РКС находятся на С-концевом участке NR1 субъединицы NMDA-рецептора (Tingley et al, 1993). Было также показано, что участки фосфорилирования РКС были обнаружены и на NR2 субъединице (Leonard et al, 1997). Регуляция активности NMDA-рецепторов одними и теми же протеинкиназами представляется сложным процессом, приводящим в разных типах клеток к противоположенным эффектам (MacDonald et al, 2001).
NMDA-рецепторы регулируют экспрессию генов в нейронах посредством активации внутриклеточных сигнальных каскадов (Рис. 9).
Изменение в экспрессии различных генов вовлечено в развитие синаптической пластичности, связанной с формированием долговременной памяти и привыканием к различным лекарствам. Митоген-активируемый протеинкиназный каскад (МАРК каскад или Erkl/2 киназный каскад), как было показано, активируется преимущественно в нейронах, но не в глиальных клетках, именно при активации NMDA-рецепторов (Wang et al, 2004).