pH-индуцируемое образование покоящихся форм микобактерий и роль аденилатциклазы в их реактивации

• Автор: Кудыкина, Юлия Константиновна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 133 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. МЕХАНИЗМЫ ВЫЖИВАНИЯ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS H37RV
В ОРГАНИЗМЕ ХОЗЯИНА
Стратегии выживания, используемые М. tuberculosis в клетках хозяина
Гены вирулентности у М. tuberculosis
Взаимодействие с сигнальными сетями хозяина
1.2 ПОКОЯЩЕЕСЯ СОСТОЯНИЕ МИКОБАКТЕРИЙ И ЛАТЕНТНОСТЬ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ
ИНФЕКЦИИ
Покоящееся состояние бактерий и модели получения ПФ In vitro
Покоящееся состояние и модели туберкулеза на животных
Молекулярные механизмы состояния покоя
Молекулярные механизмы реактивации ПФ бактерий
Роль покоя в латентном туберкулезе
1.3. АДАПТАЦИЯ МИКОБАКТЕРИЙ К КИСЛЫМ УСЛОВИЯМ pH СРЕДЫ
Чувствительность и адаптация бактерий к кислому стрессу
Проблемы, связанные с кислыми условиями среды
Защита и репарация в кислых условиях среды
Защелачивание периплазмы
Цитоплазматическая и наружняя мембраны как «кислотные» барьеры
Защита цитоплазмы при кислом стрессе
Метаболизм и регуляция цитоплазматического pH
Ионы Na* и регуляция внутриклеточного pH
Системы кислотоустойчивости
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Выращивание бактериальных культур
2.2. Подсчет общего числа клеток
2.3. Микроскопические исследования
2.4. Оценка культивируемое™ клеток..:
2.5. Реактивация «некультивируемых» клеток
2.6. Включение радиоактивной метки
2.7. Определение внутриклеточного уровня АТФ и цАМФ
2.8. Изучение чувствительности клеток к действию стрессовых факторов
2.9. Фракционирование морфологически дистинктных клеток
2.10. Определение содержания ионов аммония в клетках и культуральной жидкости
2.11. Высокоэффективная жидкостная хроматография
2.12. Выделение клеточных экстрактов
2.13. Электрофорез и иммуноблоттинг клеточных экстрактов
2.14. Выделение и очистка РНК
2.15. ПЦР в реальном времени
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. pH-ИНДУЦИРУЕМОЕ ОБРАЗОВАНИЕ ПОКОЯЩИХСЯ ФОРМ МИКОБАКТЕРИЙ
3.1.1. Адаптация микобактерий (М. smegmatls и М. tuberculosis)
к слабо-кислым условиям pH среды
3.1.2. Образование овоидных форм микобактериями (М. smegmatis и М. tuberculosis)
при снижении pH среды в пост-стационарной фазе
3.1.3. Участие генов hip и devR в адаптации клеток М. smegmatis
кзакислению среды роста
3.2. БИОХИМИЧЕСКАЯ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПФ МИКОБАКТЕРИЙ
3.2.1. Микроскопия клеток микобактерий при pH-индуцируемом переходе в
покоящееся состояние
3.2.2. Культивируемость КОК микобактерий
3.2.3. Метаболическая активность и устойчивость к повреждающим факторам
3.2.4. Инфекционный потенциал покоящихся форм МТБ
3.3. МЕХАНИЗМ РЕАКТИВАЦИИ ПОКОЯЩИХСЯ ФОРМ М. SMEGMATIS
ПОД ВЛИЯНИЕМ ВЕЩЕСТВ ЛИПИДНОЙ ПРИРОДЫ
3.3.1. Факторы реактивации липидной природы
3.3.2. Механизм действия СНЖК на клетку при реактивации
3.3.3. Роль аденилатциклазы в реактивации ПФ М. smegmatis СНЖК
3.3.4. Связь реактивации ПФ под действием СНЖК с белками Rpf
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
КОЕ - колониеобразующие единицы
04 К - общее число клеток
МКР - метод конечных разведений
НВЧК - наиболее вероятное число клеток
OD6oo - оптическая плотность при длине волны 600 нм
НК - «некультивируемые» клетки
ПФ - покоящиеся формы бактерий
БСА- бычий сывороточный альбумин
HdB - синтетическая среда Hartman’s-de Bont
mHdB - модифицированная синтетическая среда Hartman’s-de Bont
Rpf- фактор, способствующий реактивации ПФ бактерий
(англ. Resuscitation promoting factor)
Hip - гистоно-подобный белок (англ. histon-like protein)
MTB - Mycobacterium tuberculosis
МПБ (NB) - мясо-пептонный бульон (“Nutrient broth”)
CH - супернатант, полученный центрифугированием и фильтрованием через 0.2 мкм фильтр бактериальных культур
СТС - хлорид 5-циано-2,3-дитолилтетразолия, флуоресцентный краситель, детектирующий клеточное дыхание
PI - propidium iodide, флуоресцентный краситель, детектирующий поврежденные клетки
CICCP - carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (электрогенный протонофор, разобщитель дыхательной цепи)
СНЖК - свободные ненасыщенные жирные кислоты ЛАМ - липоарабиноманнан
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. По данным ВОЗ, каждый третий человек на Земле латентно инфицирован возбудителем туберкулеза - Mycobacterium tuberculosis (МТБ), но до сих пор единого понимания природы латентного состояния и механизмов, посредством которых оно регулируется, не существует. Известно, что клетки МТБ могут сохраняться в организме человека в течение длительного периода времени в особом физиологическом, нерепликативном (покоящемся) состоянии (Arend & van Dissel, 2002; Flynn & Chan, 2001; Gupta et al; Soper & Amberson, 1938). Покоящиеся клетки МТБ, которые являются, как полагают многие авторы, причиной латентного туберкулеза, до сих пор не были изолированы из тканей хозяина, так как их количество в инфицированных органах или тканях может быть крайне мало (Hernandez-Pando et al, 2000). Кроме того, покоящиеся клетки микобактерий могут быть условно «некультивируемыми» (т.е. не способными образовывать колонии на плотной среде, в норме обеспечивающей рост вегетативных клеток), и поэтому не обнаруживаются при посевах клинических образцов (Biketov et al, 2000; de Wit et al, 1995; Dhillon et al, 2004; Khomenko & Golyshevskaya, 1984; McCune et al, 1956; McCune & Tompsett, 1956). Несмотря на длительную историю исследований МТБ in vitro и in vivo, явление покоя клеток микобактерий до сих пор остается во многом неизученным, что связано, в том числе, с отсутствием моделей in vitro, в которых образовывались бы покоящиеся клетки микобактерий в достаточном для изучения количестве. Логично предположить, что покоящиеся формы могут быть получены в лабораторных культурах в условиях, имитирующих ситуацию в организме хозяина.
При попадании в организм микобактерии захватываются клетками иммунной системы - альвеолярными макрофагами. В активированных макрофагах микобактерии подвергаются воздействию активных форм кислорода, оксида азота, гидролитических ферментов лизосом, а также низких значений pH, но при этом полной гибели возбудителя туберкулеза не происходит (Rook et al, 2001). Более того, микобактерии способны выживать в условиях внутри макрофага (Deretic & Fratti, 1999) даже при pH 6.0 (Chakraborty et al, 1994; Sturgill-Koszycki et al, 1994; Xu et al, 1994). Поскольку вегетативные клетки микобактерий чувствительны к низким значениям pH (Rao et al, 2001), вероятно, некоторые захваченные фагоцитами клетки могут перейти в состояние низкой метаболической активности или покоя. Действительно, после размножения МТБ в макрофагах имел место переход клеток в «некультивируемое» состояние, реактивация из которого могла осуществляться только в жидкой среде (Biketov et al, 2000).

(Lavollay et al, 2008), вероятно, это связано с утолщением клеточной стенки в условиях стресса. Таким образом, микобактерии обладают некоторыми адаптивными механизмами, позволяющим перестраивать клеточную стенку как для повышения резистентности при переходе в покоящееся состояние, так и реактивации при выходе из этого состояния. Некоторые авторы утверждают, что белок RpfB взаимодействует с другой пептидогликан гидролазой - RipA, имеющей важное значение для вегетативного роста бактерии (Hett et al, 2008; Hett et al, 2007).
Роль покоя в латентном туберкулезе. Имеется множество прямых и косвенных доказательств того, что в человеческом организме присутствуют неделящиеся туберкулезные бактерии. Этот вывод базируется на результатах туберкулинового теста, подтверждающего очевидность заражения. Comstock с соавторами, после обработки данных примерно 0.5 миллиона пациентов (Comstock et al, 1974) сделали выводы, что «...инкубационный период туберкулезного заболевания может длиться от нескольких недель, так и всю жизнь ... продолжительность и изменчивость инкубационного периода гораздо ниже в присутствии других инфекционных заболеваний». В пост-инфекционном развитии заболевания возраст человека играет важную роль: имеется пик в раннем детстве, в позднем подростковым возрасте, и третий подъем наблюдается в популяции 65-летнего возраста и старше. Этот поздний подъем объясняется, главным образом, рецидивом заболевания при реактивации покоящихся бактерий, которые сохранились после первоначального заражения (произошедшего 50 лет назад) и активировались в результате снижения иммунной защиты стареющего организма (Dutt & Stead, 1993).
В 1952 году Медлар с соавторами (Medlar, 1952) сообщили, что в большей половине исследованных зараженных тканей содержались кислото-устойчивые бациллы, которые были видны микроскопически, но не высевались. Эти наблюдения, подтвержденные многими другими авторами (Beck & Yegian, 1952; Salkin & Wayne, 1956), являются важными, так как медицинские и хирургические решения зависят от того, мертвые это бактерии или они способны восстановиться и вызвать рецидив заболевания (Hobby et al, 1954). Хоменко с соавторами на протяжении многих лет исследовал различные формы М. tuberculosis в тканях больных. Он пришел к выводу о существовании специальных мелких (фильтрующихся) форм М. tuberculosis, которые, как предполагается, и являются формами латентного существования туберкулеза. Далее было продемонстрировано, что введение в организм животного таких форм вызывает во многих случаях туберкулезный процесс с последующим высевом возбудителя. Интересно, что формы Хоменко не могли быть культивируемы на стандартных средах (Khomenko & Golyshevskaya, 1984).