Исследование синтеза и стабильности амилолитических ферментов мицелиальным грибом Aspergillus niger штамм Л-4

• Автор: Кабанов, Александр Владимирович
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 104 с. : ил.

Содержание:
Введение

1 Обзор литературы

1.1. Особенности энергетического обмена аспергиллов

1.2. Характеристика и роль амилолитических ферментов

в энергетическом обмене аспергиллов

1.3. Молекулярно-генетические и биохимические аспекты

синтеза амилолитических ферментов

1.4. Структура и функции грибных амилаз

1.5. Значение амилаз в промышленности и медицине

1.6. Заключение
2. Материалы и методы
3. Результаты исследования
3.1. Активность амилолитических ферментов
и биомасса в процессе роста грибных клеток
3.2. Аминокислотный состав амилолитических ферментов
3.3. Молекулярная гетерогенность глюкоамилазы
3.4. Молекулярная гетерогенность альфа-амилазы
3.5. Выделение и очистка глюкоамилазы
3.6. Определение молекулярной массы глюкоамилазы
3.7. Изучение кинетических характеристик глюкоамилазы
3.8. Исследование обмена глюкоамилазы и общего белка
в клетках мицелиального гриба Aspergillus niger
3.9. Индукция синтеза глюкоамилазы крахмалом
4. Обсуждение результатов
Заключение
Выводы
Список литературы

Список сокращений:
АТФ- аденозинтрифосфорная кислота;
ДНК- дезоксирибонуклеиновая кислота; кДа- килодальтон;
Ксекр- константа скорости секреции; мРНК- матричная рибонуклеиновая кислота;
НАД*Н2- восстановленная форма никотинамид-адениндинуклеотида; Олиго-dT- короткая последовательность нуклеотидов, построенных на основе дезоксирибозы и Тимина;
ПААТ - полиакриламидный гель;
РНК- рибонуклеиновая кислота; трис- трис-гидроксиметиламинометан;
ФАД*Н2- восстановленная форма флавин-адениндинуклеотида;
Ala- аланин;
Arg-аргини;
Asn- аспарагин;
Asp- аспарагиновая кислота;
AUG- кодон «аденин-урацил-гуанин»;
D400,D490- оптические плотности растворов при соответствующих длинах волн света;
Е- истинное содержание фермента; g- ускорение свободного падения;
G1,G2- традиционное обозначение тяжелой и легкой (соответственно) молекулярных форм глюкоамилазы;
Gal- галактоза;
Glc- глюкоаз;
GlcNAc- N-ацетил-глюкозамин;
Glu- глутаминовая кислота;
Gly- глицин;

Ile- изолейцин;
Kd- константа скорости деградации;
Km- константа Михаэлиса;
Ks- константа скорости синтеза;
Leu-лейцин;
Lys- лизин;
Man- манноза;
Met- метионин;
Phe- фенилаланин;
рКа- показатель (отрицательный логарифм) константы кислотности; SDS- додецилсульфат натрия;
Ser- серии;
Т1/2" период полураспада;
TEMED- тетраэтил-метил-этилендиамин ;
Thr- триптофан;
UAG- кодон «урацил-аденин-гуанин»;
Val- Валин;
Vmax- максимальная скорость ферментативной реакции;
Ху1- ксилоза;
X- длина волны излучения.

фермент неустойчив; это свидетельствует о том, что структура активного центра в домене разрушается между Ser-443 и Ser-444, причем участок Ser-444 - Val-470 имеет дисульфидный мостик и взаимодействует с кластером воды (7 молекул) в каталитическом домене. Крахмалсвязывающий домен (Thr-513 - Arg-616) не образует тесного контакта с каталитическим доменом, поэтому обладает значительной подвижностью.
Было показано, что О-гликозилированная область глюкоамилазы Aspergillus niger участвует в разрыве водородных связей между соседними цепями в гранулярном крахмале. Крахмалсвязывающий домен определяет связывание растворимых лигандов (бета-циклодекстринов) [Hayachida S. et al., 1989]. Каталитический и крахмалсвязывающий центры глюкоамилазы некоторые авторы рассматривают как глобулярные частицы, имеющие диаметр 6 нм и 2,5 нм, причем в нативном ферменте они разделены расстоянием 10 нм. О-гликозилированный участок обусловливает взаимодействие глобул и значительную мобильность третичной структуры, а также способствует включению фермента в мембраны [Williamson G.et al., 1992]. Гликозилирование предотвращает излишнее скопление молекул субстрата в связывающих центрах и обеспечивает стехиометрическое связывание.
По мнению ряда авторов, в связывании молекул субстрата участвует прежде всего Тгр-120, входящий в состав первого подцентра. При модификации этого аминокислотного остатка с помощью генно-инженерных подходов молекула фермента утрачивала каталитическую активность. Взаимодействие с Тгр-120, участвующем в формировании щели активного центра, приводит к втягиванию молекулы субстрата в щель активного центра и сопровождается искривлением гликозидной связи. Роль функциональных каталитических групп играют Glu-179, Glu-400 и Asp-55.
Щель активного центра имеет некомпенсированный отрицательный заряд, анионные группы занимают определенное положение и сольватированы. Молекула субстрата, входит в полость активного центра (среда в нем менее