Исследование некоторых физико-химических свойств молокосвертывающих ферментов вешенки обыкновенной

• Автор: Дьяконова, Галина Вячеславовна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Ростов-на-Дону
• Количество страниц: 90 с. : ил.

Оглавление
Оглавление

Введение

1.1 Протеолитические ферменты высших грибов

1.2 Практическое применение протеиназ грибов

1.3 Молокосвертывающие ферменты, применяемые в сыроделии

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Постановка эксперимента

2.2 Получение биологического материала

2.3.Определение количества белка в плодовых телах вешенки обыкновенной

2.4 Методы исследования протеолитической активности ферментов экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной по природным субстратам
2.4.1 Определение протеолитической активности ферментов экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной по молочно-ацетатной смеси
2.4.2 Определение протеолитической активности ферментов экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной по денатурированному гемоглобину
2.4.3 Определение активности щелочных протеиназ экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной по казеину
2.5 Методы определения физико-химических свойств
2.5.2 Определение pH стабильности молокосвертывающих ферментов вешенки обыкновенной
2.5.3 Определение термостабильности молокосвертывающих ферментов вешенки обыкновенной
2.5.4 Определения температурного оптимума активности молокосвертывающих ферментов вешенки обыкновенной
2.5.5 Методика изучения действия ингибиторов на молокосвертывающие ферменты экстракта вешенки обыкновенной
2.6 Определение оптимальных условий экстрагирования молокосвертывающих ферментов из плодовых тел вешенки обыкновенной
2.7 Ступенчатое фракционирование белков из экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной сульфатом аммония
2.8 Осаждение белков, обладающих молокосвертывающей активностью, из экстракта плодовых тел вешенки обыкнолвенной с помощью хлорида натрия

2.9 Гель-хроматографичекое разделение белков экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной
2.10 Изоэлектрическое фокусирование белков экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной
2.11 Ионообменная хроматография белков экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной
2.12 Метод получения сырного сгустка
2.13 Статистическая обработка
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1 Сравнительная оценка методов определения концентрации белка в экстракте плодовых тел вешенки обыкновенной
3.3 Определение оптимальных условий экстрагирования белков из плодовых тел вешенки обыкновенной
3.4 Осаждение белков из экстракта плодовых тел вешенки обыкновенно: сульфатом аммония
3.5 Осаждение белков из экстракта плодовых тел вешенки обыкновенно хлоридом натрия
3.7 Изоэлектрическое фокусирование белковой фракции плодовых тел вешенки обыкновенной, обладающей молокосвертывающей активностью
3.8 Ионообменная хроматография молокосвертывающих белков плодовых тел вешенки обыкновенной
3.9 Изучение физико-химических свойств молокосвертывающих белкод плодовых тел вешенки обыкновенной
3.10 Сравнительный анализ физико-химических свойств молокосвертывающих протеиназ вешенки обыкновенной с протеиназахд из грибов, животных и растений
3.11 Получение сырного сгустка
3.12 Способ получения ферментного препарата из плодовых тел вешеддд
обыкновенной
Заключение
Выводы
Список литературы
Перечень использованных сокращений
Приложение А
Приложение Б
Приложение В

Введение
В связи с возрастающим дефицитом в пищевой промышленности дро теиназ сычужного действия остается актуальным поиск новых продуцентов таких ферментов, в том числе среди базидиальных грибов. МногочиследНые исследования свидетельствуют о том, что среди базидиальных деревоа3ру шающих грибов имеются активные продуценты мол око свертывающи>£ -Пр0 теиназ (Бойко, Стадничук, 2001). По сравнению с широко используецусыми продуцентами молокосвертывающих протеиназ родов End.oth.ia и Aspef-ynus базидиомицеты имеют ряд преимуществ. Например, отсутствие плодоцоще ния в культуре, что позволяет снизить риск развития аллергических Заболе ваний, а также отсутствие загрязнения ферментных препаратов бактерИаль ными культурами. Установлено, что гриб Irpex lacteus Fr. способен образе вывать протеиназы, которые могут стать заменителями сычужного Фертугента (Kikuchi, Kobayashi, Kusakabe, 1985). Способы получения соответству10щего ферментного препарата и молочных продуктов с использованием Данного ферментного препарата защищены международными патентами (Urntecj States Patent 3607655, 3212905, 3275453). Скрининговые исследования показали наличие молокосвертывающей активности у многих видов базцдиаль ных грибов (Федорова, 1973), в том числе и для некоторых культивируемых в промышленных масштабах. Например, в культуральном фильтрате Вещенки обыкновенной (Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm.) обнаружены пР°Теиназы способные створаживать молоко. Данный вид гриба выращивается по всему миру, не токсичен. Его плодовые тела перспективны для всестороннего исследования, так как могут являться относительно дешевым и удобным сырьем для получения ферментных препаратов.
Целью нашей работы являлось выделение, очистка и изучение физико-химических свойств молокосвертывающих ферментов вешенки обыкновенной (Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm.), а также возможность использования

раствором кислоты или щелочи определенного pH в количестве 1: 1 по объему, выдерживали в течение двух часов при комнатной температуре; затем, после повторного экстрагирования, оценивали молокосвертывающую активность по методу Пятницкого. Активность оценивали в трех повторностях. pH доводили с помощью 1н раствора НС1 и 1 н раствора ИаОН.
2.7 Ступенчатое фракционирование белков из экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной сульфатом аммония
Принцип метода заключается в том, что различные белки осаждаются из раствора при различной концентрации соли. Постепенно повышая концентрацию соли, можно получить ряд отдельных фракций с преимущественным содержанием выделяемого фермента в одной из них.
Степень насыщения экстракта сульфатом аммония, при которой в осадок выпадут молокосвертывающие ферменты, определяли ступенчатым фракционированием. Количество сульфата аммония, необходимое для получения нужной степени насыщения вычисляли по формуле:
0,515-Г-(С2-С,)
1- 0,272 -С2 ’
где X- количество сульфата аммония (г), добавляемое для получения необходимой степени насыщения;
V - исходный объем экстракта (мл) с концентрацией Сь равной первой степени насыщения;
С-2 - требуемая степень насыщения (Кочетов, 1980).
Эксперимент проводили следующим образом. К необходимому объему экстракта добавляли рассчитанное количество сульфата аммония до 0,1 степени насыщения. Оставляли экстракт при температуре 4 °С на 30 минут, затем фильтровали. После этого измеряли объем экстракта, рассчитывали необходимое количество соли для степени насыщения 0,2 и повторяли описанную процедуру. Таким образом, постепенно доводя экстракт до полного на-