Синтез ДНК через повреждение, катализируемый ДНК-полимеразами β и λ

• Автор: Белоусова, Екатерина Анатольевна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 146 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ:

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Номенклатура ДНК-потмераз

1.2. Особенности строения ДНК-полимераз

1.2.1. ДНК-полимеразы Х-семейства: структурные характеристики (дометая организация)

1.2.2. Механизм работы полимеразного центра

1.3. ДНК-полимераза р

1.3.1. Структурная организация ДНК-полимеразы р

1.3.2. Биохимические свойства ДНК-полимеразы Р

1.3.3. Биологическая роль ДНК-полимеразы р
1.3.4. ДНК-полимераза /?: канцерогенез и старение
1.4. ДНК-полимераза Л
1.4.1. Структурная организация ДНК-полимеразы Л
1.4.2. Биохимические свойства ДНК-полимеразы Л
1.4.3. Биологическая роль ДНК-полимеразы X
1.5. Синтез ДНК через повреждение
1.5.1. Общие сведения
1.5.2. Участие ДНК-полимераз р иЛв синтезе ДНК через повреждение
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Выделение рекомбинантной ДНК-полимеразы Я человека
2.2. Выделение рекомбинантной ДНК-полимеразы Р человека
2.3. Выделение ядерного экстракта из клеток семенников крупного рогатого скота
2.4. Выделение ядерного экстракта из клеток HeLa
2.5. Анализ белковых препаратов методом dot-blotting
2.6. Получение 5'-[32Р]-радиоактивно меченых праймеров
2.7. Определение констант диссоциации Ка комплексов ДНК ДНК-полимераза [І и.. 57 ДНК ДНК-полимераза Л методом задержки в геле
2.8. Синтез 5'-[32Р]-радиоактивно меченых олигонуклеотидов

ДНК-полимеразами Р и X
2.9. Определение кинетических параметров реакции полимеризации, катализируемой ДНК-полимер азами р и X
2.10. Синтез ДНК через Tg, катализируемый ДНК-полимеразой Л, наДНК-субстратах DNAgap5
2.11. Влияние ИКРА и его мутантной формы hABCD на TLS-активность ДНК-полимеразы X при синтезе ДНК-субстратов, содержащих протяженные 5'-оц-участки
2.12. Влияние hRPA и hPCNA на TLS-активность ДНК-полимераз Р и Л при синтезе ДНК-субстратов, содержащих бреши
2.13. Синтез ДНК, катализируемый белками ядерного экстракта клеток HeLa, на THF-, 8oxoG- и G-содержащих матрицах
2.14. Связывание ДНК-субстратов, содержащих G-, 8oxoG- и THF-фрагменты, белками ядерного экстракта клеток HeLa после синтеза ДНК в экстракте
2.15. Синтез фотореакционноспособных 5'-f2P]-радиоактивно меченых
ДНК-праймеров с помощью ДНК-полимеразы Р
2.16. Связывание предсинтезированых ДНК-субстратов, содержащих G-, 8oxoG- и THF-фрагменты, белками ядерного экстракта клеток HeLa
2.17. Фотоаффинная модификация ДНК-полимераз Р и и Л, PARP1 и белков ядерных экстрактов Bovine testis и клеток HeLa
2.18. Идентификация продуктов модификации белков ядерного экстракта Bovine testis методом иммунопреципитации
2.19. Идентификация продуктов модификации белков ядерного экстракта клеток HeLa методом иммуноблотинга
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Определение констант диссоциации K,i комплексов ДНКДНК-полимераза ф и ДНК ДНК-полимераза Л
3.2. Синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразами ф и X, на ДНК-субстратах, содержащих различные типы повреждений: влияние ионов Mg2+ и Мп2+
3.2.1. Синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой Д на THF-содержащих матрицах: влияние ионов Mg2+
3.2.2. Синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой ф, на THF-содержащих матрицах: влияние ионов Мп2+

3.2.3. Синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой Д на 8охоС-содержащих матрицах: влияние ионов
3.2.4. Синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой /3, на 8охоС-содержащих матрицах: влияние ионов Мп2+
3.2.5. Синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой Д на Т%-содержащих матрицах: влияние ионов М+
3.2.6. Синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой Д на Tg-coдepэcaщux матрицах: влияние ионов Мп2+
3.2.7. Синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой X, на ТНИ-содержащих матрицах: влияние ионов Mg2+
3.2.8. Синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой X, на ТНК-содержащих матрицах: влияние ионов Мп2+
3.2.9. Синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой X, на 8охоС-содержащих матрицах: влияние ионов М,%2+
3.2.10. Синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой X, на 8охоС-содержащих матрицах: влияние ионов Мп2+
3.2.11. Синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой X, на Tg-coдepжaщux матрицах: влияние ионов М+
3.2.12. Синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой X, на Tg-coдepжaщux
матрицах: влияние ионов Мп2+
3.3. Влияние ИКРА и йРСМА на синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразами р и X, на ДНК-субстратах, имитирующих интермедиаты ТЬБ при репликации лидирующей и отстающей цепей ДНК
3.3.1. Влияние ИЯРА на синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой X, на 8охоО-содержащих матрицах, имитирующих интермедиаты ТЬЗ при репликации лидирующей цепи ДНК
3.3.2. Влияние ИКРА на синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой Д на ТНК- и 8охоС-содержащих матрицах, имитирующих интермедиаты ТЬ8 при репликации отстающей цепи ДНК
3.3.3. Влияние ИКРА па синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой Д на Tg-содержащих матрицах, имитирующих интермедиаты ТТЯ при репликации отстающей цепи ДНК

вовлечена в патогенез при болезни Альцгеймера [181]. На примере экстрактов нейронов коры головного мозга лабораторных беспородных крыс разных возрастов (5 дней, б и 24 месяца) было показано, что с возрастом репарационная активность клеток снижается [182]. Введение рекомбинантной ДНК-полимеразы р восстанавливает ВЕЯ-активность экстрактов; скорость репарационного процесса увеличивается при использовании комбинации ДНК-полимеразы Р и ДНК-лигазы фага Т4 [182].
Значительное число работ посвящено исследованию структуры и функций ДНК-полимеразы р. Помимо того, что этот моносубъединичный фермент оказался очень удобной моделью для исследования механизма действия ДНК-полимераз, он является необходимым для жизнедеятельности организма. Одна из основных функций ДНК-полимеразы р тесно связана с нормальной работой системы эксцизионной репарации оснований, контролирующей наличие повреждений ДНК, вызванных действием алкилирующих агентов, ионизирующей радиации, активных форм кислорода. Кроме того, ДНК-полимераза Р является одной из ключевых "мишеней" при возникновении и развитии онкологических заболеваний. Несмотря на столь подробное изучение структуры и функций ДНК-полимеразы р, остается ряд нерешенных вопросов, связанных с ролью этого фермента в процессах прохождения клеточного цикла, при стрессовых нагрузках и патогенезе.
1.4. ДНК-потшераза X
1.4.1. Структурная организация ДНК-полимеразы X
Еще один представитель Х-семейства ДНК-полимераз - ДНК-полимераза X. Ген этого белка был идентифицирован в разных эукариотических организмах, включая растения [17, 183]. Как и остальные представители Х-семейства, ДНК-полимераза X - сравнительно небольшой односубъединичный фермент (575 а.о., 63,5 кДа), лишенный 3'—>5'-экзонуклеазной активности [17, 26, 184] (рис. 1.7). На Х-конце он содержит последовательность, ответственную за транспорт белка в ядро (1-35 а.о.), далее идет ВЯСТ-домен (36-132 а.о.), серин-пролин-богатая область (133-243) и каталитический домен, аналогичный каталитическому домену ДНК-полимеразы (1 (244-575 а.о.). ВЯСТ-домен определяет белок-белковые взаимодействия ДНК-полимеразы X с белками-участниками ЫНЕ1 [185, 48]. Серин-пролин-богатая область является целевым участком для посттрансляционной модификации белка, в частности, подвергается фосфорилированию комплексом Сйк2/А в Э-фазе клеточного цикла [17, 186]. Кроме того,