Влияние полиэлектролитов на функциональную активность и агрегационное состояние глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы

• Автор: Стогов, Сергей Владимирович
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 120 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

И-глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа: структура, свойства и

функции

Структура глицералъдегид-3-фосфатдегидрогеназы

Механизм дегидрогеназной реакции

Многофункциональность глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы„„

Синтетические иолиэлектролиты и их полнкомплексы

Основные свойства полиэлектролитных комплексов

Основные свойства белок-полиэлектролитных комплексов
Применение синтетических полиэлектролитов в биотехнологии
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалы
Методы
Выделение глицералъдегид-3-фосфатдегидрогеназы из скелетных мышц
кролика
Выделение телец включения, содержащих зелёный флуоресцентный
белок
Определение концентрации реагентов
Определение концентрации белков
Определение активности глицералъдегид-3-фосфатдегидрогеназы
Приготовление растворов полиэлектролитов
Термоинактивация глицералъдегид-3-фосфатдегидрогеназы в смесях с
полиэлектролитами
Кинетика агрегации белка
Метод дифференциальной сканирующей калориметрии
Получение спектров кругового дихроизма
Спектрофотометрическое изучение растворения телец включения ОПР

Метод динамического лазерного светорассеяния
Электрофорез белков по методу Лэммли
Рассчёт относительной гидрофобности мономерных звеньев
полисулъфоанионов
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Раздел 1. Влияние полианионов на термоагрегацию ГАФД
Раздел 2. Влияние полисульфоанионов на структуру и
функциональное состояние ГАФД
Влияние полисульфоанионов на функциональное состояние ГАФД
Влияние полисульфоанионов на четвертичную структуру ГАФД
Влияние полисульфоанионов на третичную структуру ГАФД
Влияние полисульфоанионов на вторичную структуру ГАФД
Раздел 3. Изучение возможности использования полисульфоанионов
для растворения белковых агрегатов
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
БСА - бычий сывороточный альбумин
Г АФД - глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа
ГАФДс - сперматозоидная изоформа глицеральдегид
фосфатдегидрогеназы
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ДС - декстрансульфат натрия
ДСК - дифференциальная сканирующая калориметрия
ДТТ - 1,4-дитио-БЬ-треитол
1,3-ДФГ - 1,3-дифосфоглицериновая кислота
ПА - полиакрилат натрия
ПАК - полиакриловая кислота
ПАМС - поли-2-акриламид-2-метил-1 -пропансульфонат калия
ПАС - полианетолсульфонат натрия
ПМА - полиметакрилат натрия
ПВС - поливинилсульфат калия
ПСС - полистиролсульфонат натрия
ПЭВП - поли-М-этил-4-винилпиридиний бромид
РНК - рибонуклеиновая кислота
СП - степень полимеризации
ТЕМЕД - М,Н,Н',1Р-тетраметилэтилендиамин
Тм - максимум термоденатурации белков
Трис - трис (гидроксиметил) аминометан
Широкое применение получил pH чувствительный сополимер полиакриловой и полиметакриловой кислот, который способен осаждаться в кислых растворах при значения pH ниже 5 (Guoqïang et al., 1993; Linne’-Larsson and Mattiasson, 1994). Обратимая растворимость сополимера применяется в медицине. Таблетки, покрытые полиэлектролитной плёнкой нерастворимы в кислой среде желудка, таким образом, её компоненты защищены от воздействия желудочного сока. При попадании в кишечник с нейтральными значениями pH оболочка растворяется и обеспечивает выход содержимого препарата. Так же широко используется нейтрализация зарядов

на полиэлектролитах, которая запускается их осаждением за счёт добавления-противоположно заряженного полимера (Dissing and Mattiasson, 1996; Dainiak et al., 1999, 2000).
Водные растворы двух полимеров с различными структурами способны образовывать двухфазовые системы, успешно применимых при разделении смесей. Технически это основано на том факте, что целевая молекула белка имеет слабое преимущество к обеим фазам. Разбиение на специфические фазы может улучшаться внесением в систему специфических молекул носителей, которые будут находиться только в определенной фазе, при этом обладающих большим сродством к целевой молекуле. Например; поликатион, полиэтиленимин, который заряжен при pH 6,0, значительно ■ улучшает отделение молочной кислоты от декстриновой фазы при этом значении pH (Planas et al., 1998). Водные двухфазовые системы могут быть сформированы из растворов полиэлектролитов, полиэтеленимина и нейтрального полимера (Dassing and Mattiasson, 1993, 1994). Свойства такой системы определяются свойствами полиэлектролита и в значительной степени зависят от ионной силы и pH раствора. Использование полиэлектролитов в водных двухфазовых системах дает возможность отделять целевые молекулы от полимеров с последующим восстановлением цепей полиэлектролитов.