Структурно-функциональная характеристика вольт-сенсорного домена калиевого канала KvAP и k-терафотоксина-Gr3a полученных в бесклеточных белоксинтезирующих системах

• Автор: Карбышев, Михаил Сергеевич
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 123 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1, ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1Л Общая характеристика мембранных белков
1.2 Клеточные системы экспрессии рекомбинантных мембранных белков. Л 3 1.3. Бесклеточные системы продукции мембранных белков
1.3.1. Источники экстрактов для бесклеточных систем - выбор оптимального варианта экспрессии мембранных белков
1.3.2. Компоненты и основные конфигурации бесклеточных систем на основе S30 экстракта E. coli
1.3.3. Форматы бесклеточных систем для продукции мембранных белков
1.4. Структура и особенности функционирования Kv-каналов
1.4.1. Роль Kv-каналов в канцерогенезе
1.4.2. Бесклеточный синтез ионных каналов и их доменов
1.5. Пептидные и низкомолекулярные ингибиторы Kv-каналов
1.5.1. Формирование дисульфидных связей в клетках Е.coli
1.5.2. Продукция белков с множественными дисульфидными связями в
бесклеточных системах
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы исследования
2.2. Методы исследования
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Получение модельных полипептидов в бесклеточной системе экспрессии на основе S30 экстракта из E. coli
3.1.1. Дизайн ДНК матриц
3.1.2. Получение S30 экстракта из E. coli
3.1.3. Влияние концентрации ионов Mg2+ и К+
3.1.4. Экспрессия ВСД-KvAP в присутствии детергентов (D-CF)
3.1.5 Экспрессия TRX-VSTX1 в растворимой форме

3.2. Выделение и очистка модельных полипептидов полученных в бесклеточной белоксинтезирующей системе
3.2.1 Растворение ВСД-КуАР из осадка реакционной смеси
3.2.2. Металл-хелатная аффинная хроматография ВСД-КуАР
3.2.3. Расщепление слитого белка ТЮ(-У8ТХ
3.3. Структурно-функциональная характеристика препаратов модельных
полипептидов
3.3.1. Изучение молекулярно-массового распределения
3.3.2 Анализ вторичной структуры и термостабильности
3.3.3. ЯМР спектроскопия модельных полипептидов
3.3.4. Расчет химических сдвигов
3.3.5.Пулл-даун анализ взаимодействия ВСД-КуАР и У8ТХ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
(His)n - гистидиновый тег ACN - ацетонитрил
BMRB - банк данных бимолекулярной ЯМР спектроскопии
CV - объем хроматографической колонки
DSS - 4,4-диметил-4-силапентан-1 -сульфоновая кислота
GSH - восстановленный глутатион
GSSG - окисленный глутатион
IAM - йодацетамид
Kv - потенциал-управляемый К+-канал
P-CF - продукция в осадок СБСП
PDB - Банк данных белковых структур Protein Data Bank
PDI - протеин дисульфид изомераза ЕС 5.4.3.
TRX - тиоредоксин
Р-ОГ - р - октил-глюкозид
АТФ - аденозинтрифосфат
БС - бесклеточный синтез
БСА - бычий сывороточный альбумин
ВСД - вольт-сенсорный домен
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
ГТФ - гунидинтрифосфат
ГФХ - гексаноилфосфатидилхолин
ДДМ - п-додецил-Р-О-мальтозид
ДМ - п-децил-р-Б-мальтозид
ДСН - додецилсульфат натрия,
ДТТ - 1,4 дитиотреитол
ДФХ - дифосфатидилхолин
ИПТГ - изопропил-Р-В-1-тиогалактопиранозид
КД - круговой дихроизм
посредством конформационных изменений не связаных с током ионов. В случае острого миелолейкоза, при котором показана, четкая корреляция экспрессии Ку11.1 и негативного прогноза, комплекс Ку11.1-(31 интегрин ассоцеирован с рецептором фактороа роста эндотелия сосудов (УЕОБ) первого типа. Данный рецептор регулирует секрецию УЕвР, пролиферацию и миграцию клеток, приводящую к более глубокой инвазии периферических сосудов и экстрамедуллярных участков у иммунодеффицитных мышей [137]. Такие комплексы как Ку1 1.1-(31 интегрин также присутствуют и при детском остром лимфобластном лейкозе, при котором блокировка сигналлинга Ку1 1.1 приводит к апопоптозу раковых клеток, что делает данный ионный канал интересной мишенью для терапевтического воздействия.
1.4.2. Бесклеточный синтез ионных каналов и их доменов В последние годы для получения МБ в количествах пригодных для осуществления полномасштабной как структурной, так и функциональной характеризации все шире используются СБСП. Учитывая высокий интерес к ионным каналам, как к мишеням для разработки новых лекарственных препаратов, весьма объясним интерес исследователей к продукции данного класса в бесклеточных системах. Данное направление широко развивается, и позволило получитьить некоторые новые данные о различных белках обуславливающих транспорт ионов через мембрану.
Так, например, в работе [138] применение СБСП позволило получить бактериальный К+-канал КсвА в форме тетрамера и установить важность состава липидных везикул, в которые данный канал был реконструирован. Также было показано, что солюбилизация мембраны с помощью детергентов снижает термостабильность тетрамерного комплекса данного белка, в то время, как наивысшая стабильность наблюдалась в присутствии липидного бислоя, в присутствии анионных липидов.
Примечательно, что одним из первых МБ, полученным в бесклеточной системе и охарактеризованном с применением метода твердофазной ЯМР-спектроскопии, является механо-чувствительный канал МвсЬ [139]. В