Молекулярные механизмы иммуномодулирующего действия кукумариозида А2-2

• Автор: Пислягин, Евгений Александрович
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Владивосток
• Количество страниц: 121 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Биологическая активность и механизм действия тритерпеновых

гликозидов

1.1.1. Структура тритерпеновых гликозидов

1.1.2. Распространение тритерпеновых гликозидов

1.1.3. Биологическая активность тритерпеновых гликозидов

1.1.4. Физико-химические основы механизма цитотоксического и мембранолитического действия тритерпеновых гликозидов

1.1.5. Иммуномодулирующая активность тритерпеновых гликозидов голотурий

1.2. Р2Х рецепторы
1.2.1. Классификация пуринорецепторов
1.2.2. Строение Р2Х рецепторов
1.2.3. Физико-химические свойства Р2Х рецепторов
1.2.4. Распространение Р2Х рецепторов и их физиологическая роль
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Кукумариозид Аг-
2.2. Животные
2.3. Получение клеток
2.4. Определение жизнеспособности клеток
2.5. Определение цитотоксической активности
2.7. Измерение микровязкости мембран клеток
2.8. Измерение мембранного потенциала клеток
2.9. Связывание 3Н-кукумариозида Аг-2 с перитонеальными макрофагами мыши
2.10. Микроцитофлуориметрическая оценка транспорта Са2+ в клетках
2.11. Регистрация трансмембранных токов в клетках методом пэтч-кламп
2.12. Иммуноцитохимическое исследование перитонеальных макрофагов
2.13. Исследование фармакокинетики кукумариозида Аг-
2.14. МАЫЗЫМБ
2.15. МАЫЗКГОР МБ
2.16. Построение модели пространственной структуры тР2Х4 рецептора мыши и кукумариозида Аг-
2.17. Статистический анализ
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Цитотоксическая активность кукумариозида А
3.2. Иммуностимулирующая активность кукумариозида Аг-
3.3. Взаимодействие кукумариозида Аг-2 с мембранами иммунокомпетентных клеток
3.3.1. Влияние на микровязкость мембран лимфоцитов селезенки мыши
3.3.2. Связывание 3Н-кукумариозида А2-2 с перитонеальными макрофагами мыши
3.3.3. Влияние кукумариозида А2-2 на мембранный потенциал перитонеальных макрофагов мыши
3.4. Изучение влияния кукумариозида А2-2 на транспорт Са2+в перитонеальных макрофагах мышей
3.5. Влияние кукумариозида Аг-2 на функционирование пуриновых рецепторов в макрофагах
3.6. Регистрация ионных токов в одиночной клетке
3.7. Типирование популяции перитонеальных макрофагов мыши, принимающих участие в Са2+ ответе на кукумариозид Аг-
3.8. Компьютерное моделирование пространственной структуры комплекса кукумариозида А2-2 с пуриновым рецептором Р2Х
3.9. Исследование фармакокинетики кукумариозида А
3.9.1. Исследование фармакокинетического поведения кукумариозида А2-2 в гомогенате селезенки мышей
3.9.2. Идентификация и количественное определение кукумариозида А2-2 в гомогенате селезенки мыши
3.9.3. Исследование стабильности кукумариозида А2-2 в тканях селезенки и оценка метаболических превращений
3.9.4. Оценка пространственного распределения кукумариозида А2-2 методом МАІЛЗІ-ІМБ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ВВЕДЕНИЕ
Тритерпеновые гликозиды голотурий изучаются на протяжении длительного времени. Установлено, что они обладают широким спектром биологической активности. Для этих соединений отмечены такие свойства, как антимикробная, хемопревентивная, иммуномодулирующая, иммуноадьювантная и противовоспалительная активности. Кроме того, тритерпеновые гликозиды обладают выраженной мембранолитической активностью, проявляющейся в микромолярном диапазоне концентраций.
Механизм мембранолитического действия этих соединений хорошо изучен и заключается в способности гликозидов изменять ионную проницаемость мембран клеток посредством взаимодействия со стеринами мембран (главным образом с холестерином) и формирования ионопроводящих структур в липидном матриксе. Вследствие образования ионных каналов и пор в мембранах нарушается ионная избирательность клеток и их ионный гомеостаз, усиливается выход из клеток жизненно важных компонентов и ингибируется ряд мембран-ассоциированных ферментов, что в итоге приводит к гибели клеток. Вероятно, что именно этим мембранотропным механизмом действия и обусловлены цитотоксическая, гемолитическая и противогрибковая активности тритерпеновых гликозидов.
В то же время известно, что в низких, нецитотоксических концентрациях, некоторые из этих соединений активируют целый ряд внутриклеточных процессов. Ранее было показано, что тритерпеновый гликозид кукумариозид Аг-2, выделенный из дальневосточной голотурии Сиситапа ]аротса, в наномолярных концентрациях обладает иммуностимулирующим действием, которое выражаются, главным образом, в активации клеточного звена иммунитета: усиливается адгезия, распластывание и подвижность макрофагов, усиливается фагоцитоз и формирование активных форм кислорода, увеличивается скорость пролиферации лимфоцитов, количество антител-образующих клеток селезенки, индуцируется синтез некоторых цитокинов. Введение препарата кумазид экспериментальным животным приводит к существенному увеличению их резистентности к различным патогенным инфекциям, к торможению роста некоторых видов опухолей и увеличению средней продолжительности жизни животных при облучении сублетальными дозами радиации. Результатом успешной работы ТИБОХ ДВО РАН в этом направлении является созданный на основе моносульфатированных тритерпеновых гликозидов голотурии Сиситапа ]аротса (главным образом, кукумариозида Аг-2) эффективный иммуностимулирующий препарат кумазид, предназначенный для профилактики и лечения иммунодефицитных состояний человека и прошедший все официальные доклинические испытания.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Кукумариозид А
Тритерпеновый гликозид кукумариозид А2-2 был получен из этанольного экстракта дальневосточной голотурии Cucumaria japonica и любезно предоставлен сотрудниками лаборатории химии морских природных соединений ТИБОХ ДВО РАН в.н.с., д.х.н. Авиловым С.А. и н.с., к.х.н. Сильчено A.C. Химическую чистоту препарата подтверждали методами 13С ЯМР спектроскопии и ESI масс-спектрометрии и сравнивали с ранее опубликованными данными (Авилов и др., 1990). Химическая структура кукумариозида А2-2 представлена на Рис.

Рис. 5 Химическая структура кукумариозида А
2.2. Животные
Мыши линии ВАЬВ/с (самки) весом 18-20 г были приобретены в питомнике РАМН «Столбовая» (Московская область, Россия) и в дальнейшем содержались в виварии ТИБОХ ДВО РАН при свободном доступе к воде и пище. Все эксперименты были проведены с соблюдением правил, этических норм и международных рекомендаций Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях (Страсбург, 18 марта 1986 г.)
2.3. Получение клеток
Получение первичной культуры спленоиитов. Мышиные спленоциты получали из селезенки мышей линии ВАЬВ/с (Хэй, 1989). С этой целью мышей забивали методом перивисцеральной дислокации, извлекали селезенку, измельчали ее с помощью ножниц и гомогенизировали с помощью стеклянного гомогенизатора в фосфатно-солевом буферном