Исследование мембранодестабилизирующих свойств гликопротеина NSP4 ротавирусов

• Автор: Пономарева, Наталья Вячеславовна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Нижний Новгород
• Количество страниц: 116 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

I.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Структурная и молекулярная организация ротавируса

1.1.1. Мор фол огия ротавириона

1.1.2. Геном

1.1.3. Белки ротавируса

1.2. Молекулярная классификация ротавирусов

1.3. Роль NSP4 в патогенезе ротавирусной инфекции

1.3.1. Патогенез ротавирусной инфекции

1.3.2. Влияние NSP4 на изменение концентрации ионов кальция
1.3.3. Влияние NSP4 на активацию нервной системы кишечника
1.3.4. Влияние NSP4 на реоганизацию цитоскелета энтероцитов
1.3.5. Мембранодестабилизирующая активность NSP4
1. 3.6. Влияние мутаций в молекуле NSP4 на вирулентность ротавируса
II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Исследуемые объекты
2.2. Электрофоретипирование РНК ротавирусов в полиакриламидном геле
2.3. Обратная транскрипция-полимеразная цепная реакция
2.4. Выделение фрагментов ДНК из агарозы
2.5. Клонирование и экспрессия гена NSP4
2.5.1. Выделение плазмидной ДНК
2.5.2. Рестрикция плазмидной ДНК и фрагментов амплификации
2.5.3. Лигирование вектора и фрагмента гена NSP4
2.5.4. Приготовление компетентных клеток Escherichia coli
2.5.5. Трансформация клеток Escherichia coli методом электропорации
2.5.6. Выделение NSP4 из культуры Escherichia coli
2.5. 7. Электрофорез белков в полиакриламидном геле

2.5. 8. Экспрессия генаЫ8Р4
2.6. Статистический анализ результатов
III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Оптимизация методики ОТ-ПЦР для амплификации полноразмерной последовательности гена И8Р4 ротавируса человека и животных
3.2. Изучение вариабельности гена И8Р4 российских изолятов ротавируса человека
3.2.1. Характеристика электрофоретипов и С[Р]-типов исследуемых изолятов ротавируса человека
3.2.2. Определение генотипа И8Р4 российских изолятов ротавируса человека
3.2.3. Филогенетический анализ российских изолятов ротавирусов человека на основе гена И8Р4
3.3. Изучение энтеротоксических свойств МБРЙ ротавирусов группы А разных генотипов
3.3.1. Разработка методики ОТ-ПЦР для амплификации последовательности ОРС гена N814 ротавируса человека
3.3.2. Создание генетической конструкции для экспрессии Ы8Р4
3.3.3. Оптимизация условий экспрессии И8Р4
3.3.4. Экспрессия Ы8Р4 в составе рекомбинантной плазмиды рЕТ22Ь
3.4. Анализ аминокислотной последовательности 1Ч8Р4 ротавируса разных С[Р]-типов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АТ - аппарат Гольджи
а.о. - аминокислотные остатки
дНТФ - дезоксинуклеозидтрифосфаты
ДСН - додецилсульфат натрия
ДВБВК -домен взаимодействия с белком внутреннего капсида
ДВВЧ -домен взаимодействия с вирусными частицами
ИПТГ - изопропил-(3-0-1-тиогалактопиранозид (англ. IPTG)
кДа - кило Дальтон
кДНК - комплементарная ДНК
КРС - крупный рогатый скот
НТР - нетранслируемый регион
н.о. - нуклеотидные основания
ОРС - открытая рамка считывания
ОТ - обратная транскрипция
ПААТ - полиакриламидный гель
п.н. - пара нуклеотидов
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РВ - ротавирусы
РВИ -ротавирусная инфекция
днРНК - двунитевая рибонуклеиновая кислота
ск - сиаловая кислота
сед -суперскрученный домен
ЭДТА - этилендиаминтетраацетат натрия
ЭПР - эндоплазматический ретикулюм
ЭФ - электрофорез
ENS - enteric nervous system
NSP - nonstructural protein (неструктурный протеин)
VP - virus protein (вирусный протеин)

взаимодействию с липидным компонентом цитоплазматической мембраны, привело к возникновению гипотезы, что гомотетрамер №Р41]2.175 формирует кальциевый ионный канал [22]. Другими словами, №Р4 может функционировать подобно виропоринам. Эти белки имеют гидрофобную трансмембранную область, которая взаимодействует с бислоем липидов, и формируют при олигомеризации гидрофильные поры, вызывая усиленный проход ионов и небольших молекул [53, 63]. Эти находки говорят, что №Р4 имеет несколько детерминант вирулентности [104].
Итак, мембранодестабилизирующие и энтеротоксические свойства №Р4 могут быть связаны с различными регионами полипептида. Показано присутствие во внеклеточном пространстве Ы8Р4ц2-175- С другой стороны, широко обсуждается возможность тетрамеризации молекул №Р4 за счет взаимодействия суперскрученных доменов Н8Р495.1з7. Из-за того, что эти учаСТКИ ПереКрЫВаЮТСЯ, НеВОЗМОЖНО ПОЛУЧИТЬ ИЗ ОДНОЙ МОЛекуЛЫ П8Р4ц2-175 и И8Р495.1з7 одновременно. Из этого следует, что в процессе созревания вирусных частиц существует несколько альтернативных вариантов процессинга молекулы И8Р4. Вероятно, это связано с избыточной конститутивной экспрессией этого белка в зараженных клетках. Часть молекул, связываясь с созревающими вирусными частицами выполняет свое прямое предназначение и приводит к образованию внеклеточной формы И8Р4. Другая часть, не провзаимодействовавшая с двухслойными частицами, но, тем не менее, оказавшаяся на цитоплазматической мембране, попадает под действие протеаз, что ведет к образованию других форм №Р4, которые также способны оказывать энтеротоксическое воздействие на зараженную клетку и соседние с ней клетки. Выяснение всех форм И8Р4, которые присутствуют в инфицированной ротавирусом клетке и во внеклеточном пространстве, является предметом дальнейших исследований.