Получение и исследование свойств рекомбинантных фрагментов антитела, специфичного к сердечной изоформе тропонина I

• Автор: Альтшулер, Евгений Петрович
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 187 с. : ил.

Список используемых сокращений
BITC - биотинизотиоцианат.
CDR — участки молекулы антитела, распознающие антиген (complementarity determining regions).
Сн - константный домен тяжелой цепи (constant domain of the heavy chain).
Cl — константный домен легкой цепи (constant domain of the light chain). dNTP - дезоксирибонуклеотидтрифосфаты.
dsFv - двуцепочечный Fv фрагмент, в котором домены соединены дисульфидной связью.
eFab - Fab-фрагменты антитела 19С7, полученные путем ограниченного протеолиза полноразмерного антитела под действием папаина.
F(ab)2 — фрагмент, получаемый из полноразмерного антитела под действием пепсина, представляет собой два Fab-фрагмента, соединенных шарнирным участком.
Fab - антиген-связывающий фрагмент антитела (fragment, antigen-binding), состоящий из легкой цепи и вариабельного и первого константного доменов тяжелой цепи.
Fc — кристаллизуемый фрагмент антитела (fragment, crystallizable), образованный С-концевыми константными доменами тяжелых цепей Сн2 и СнЗ.
FcRB - Fc Brambell receptor.
FR - каркасные участки молекулы антитела (framework regions).
Fv - фрагмент антитела, образованный из вариабельных доменов легкой и тяжелой цепи (variable fragment).
GSH - восстановленный глутатион.
GSSG - окисленный глутатион.
НС или ТЦ - тяжелая цепь иммуноглобулинов (heavy chain). hcTnl - изоформа тропонина I, экспрессируемая в сердце человека.
1C и ITC - двойной и тройной тропониновый комплекс из субъединиц I, Т и С, соответственно.
Ig - иммуноглобулины.
IgG - иммуноглобулины класса G.
IgGACH2 - рекомбинантное антитело класса IgG, в котором отсутствует второй константный домен.
1PTG - изопропил-P-D-1 -тиогалактопиранозид.
LB - среда Лурия-Бертани.
LC или ЛЦ - легкая цепь иммуноглобулинов (light chain).

МАт 19C7-BITC - моноклональное антитело 19С7, биотинилированное с использованием биотинизотиоцианата (BITC).
Minibody — рекомбинантная конструкция, составленная из двух scFv-фрагментов, соединенных шарнирным участком с третьими константными доменами тяжелых цепей.
M-MLV - Moloney Murine Leukemia Virus.
MPB - малеимид-ПЭГг i-биотин.
Oligo(dT) - олигонуклеотид, состоящий из нескольких тимидинов.
PMSF - фенилметилсульфонилфторид.
гАЬ - рекомбинантное антитело.
rFab — рекомбинантный Fab-фрагмент антитела.
scFv-фрагмент - фрагмент антитела, состоящий из вариабельных доменов легкой и тяжелой цепи, «сшитых» линкерным пептидом.
(scFv)2 - фрагмент антител, образованный двумя scFv-фрагментами, объединенными линкерным пептидом.
scFv-BITC — scFv-фрагменты МАт 19С7, биотинилированные с использованием биотинизотиоцианата (BITC).
scFv-Fc — рекомбинантное антитело, в котором отсутствуют первые константные домены (Сн1), а вариабельные домены соединены непосредственно со вторыми константными доменами.
scFv-MPB — scFv-фрагменты МАт 19С7, биотинилированные с использованием малеимид-ПЭГц-биотина (МРВ).
SDR - аминокислотные остатки CDR, определяющие специфичность взаимодействия с антигеном (specificity determining regions).
SPR - метод поверхностного плазмонного резонанса (surface plasmon resonance).
TEKES - хелат европия.
Tetrabody - рекомбинантная конструкция, составленная из четырех scFv-фрагментов Triabody - рекомбинантная конструкция, составленная из трех scFv-фрагментов.
Vh — вариабельный домен тяжелой цепи (variable domain of the heavy chain).
Vl - вариабельный домен легкой цепи (variable domain of the light chain), a.o. - аминокислотный остаток.
БСА — бычий сывороточный альбумин.
ДСН - додецилсульфат натрия.
ИФА - иммуноферментный анализ.
кДНК - комплементарная ДНК, то есть ДНК, синтезированная с матричной РНК путем обратной транскрипции.

МАт (или МАЬ) - моноклональное антитело.
МГК - молекулярно-генетическая конструкция, м.м. — молекулярная масса.
ПААГ — полиакриламидный гель, п. о. — пары оснований.
ПЦР — полимеразная цепная реакция.
ТВ - тельца включения.
ФИА - флуороиммунный анализ.
ФСБ - фосфатно-солевой буфер.
ФСБТ - фосфатно-солевой буфер, содержащий 0.1% Ту/ееп-20. фТД - фрагмент тяжелой цепи.
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота.

и рибосомный дисплеи), позволяют осуществлять скрининг библиотек большего размера, чем в случае фагового дисплея [80, 114, 117]. Одним из ограничений дисплейных методов является неравномерность экспрессии различных мутантных форм антител. Возможны ситуации, когда наличие единственной аминокислотной замены полностью блокирует экспрессию мутантной формы антитела [118]. Кроме этого, при наличии библиотек, состоящих из большого числа вариантов, например, 1010 1013, возникают сложности, связанные с невозможностью рассмотрения и анализа каждого варианта. Этот момент следует учитывать при создании и использовании подобных библиотек.

In vitro транскрипция
мРНК
Отвратная транскрипция и ПЦР
Элюция комплекса мРНК-белок
ПЦР-мутагенез

I.Очистка комплекса
белок-мРНК
2. Отбор по связыванию
антигена
In vitro лигирование
+ — ДНК-линкер
пуромицин

In vitro трансляция
иммобилизованный
антиген
А-сайт
рибосомы
Рис. 6. Метод мРНК дисплея. Путем лигирования in vitro транскрибированной мРНК с пуромицином с помощью ДНК-линкера можно создавать комплексы мРНК-белок. Завершая in vitro трансляцию, рибосома останавливается на месте «соединения» РНК и ДНК. При этом пуромицин связывается с A-сайтом рибосомы, после чего синтезированный белок транспортируется на пуромицин. Полученный ковалентный комплекс мРНК-белок может использоваться для отбора по аффинности, а затем, после элюции, для обратной транскрипции и амплификации кДНК методом ПЦР (по материалам статьи [114]).
3.2.2.5 Методические приемы отбора наиболее аффинных вариантов антител с использованием антигена
Для получения высокоаффинных антител необходимо дифференцировать антитела с низкой и высокой аффинностью. Для этого можно использовать методы отбора по кинетическим или термодинамическим параметрам антител (рис. 7) [114, 119]. Для отбора по термодинамическим параметрам (в равновесном состоянии) библиотека отбираемых