Одновременный количественный анализ бактериальных и растительных биотоксинов на гидрогелевых микрочипах

• Автор: Филиппова, Марина Александровна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 122 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Определение индивидуальных токсинов

1.1.1. Дифтерийный токсин

1.1.2. Холерный токсин

1.1.3. Сибирская язва

1.1.4. Рицин

1.1.5. Ботулинические нейротоксины

1.1.6. Стафилококковые энтеротоксины

1.2. Биосенсоры для одновременного определения нескольких токсинов в образце
1.2.1. Анализ токсинов и токсоидов
1.2.2. Определение токсинов, используя клеточные рецепторы
1.2.3. Токсины в клинических жидкостях
1.2.4. Токсины в образцах окружающей среды
1.2.5. Токсины в продуктах питания
1.3. Биологические микрочипы
1.3.1. Применение микрочипов
1.3.2. Изготовление микрочипов
1.3.2.1. Методы иммобилизации белков на хмикрочипах
1.3.2.2.Методы нанесения зондов
1.3.3.Микрочипы на основе гидрогелей
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1 Приборы и реактивы
2.2. Изготовление биочипов
2.3. Приготовление проявляющей смеси антител
2.3.1.Получение конъюгатов антител с биотином

2.3.2. Получение конъюгатов антител с флуоресцентным красителем
2.4. Приготовление калибровочных проб
2.4.1. Калибровочные пробы для одновременного анализа пятнадцати биотоксинов
2.4.2.Калибровочные пробы для одновременного анализа для семи стафилококковых энтеротоксинов
2.5. Одновременный анализ биотоксинов на биочипах
2.5.1.«Сэндвич»-иммуноанализ биотоксинов с использованием стрептавидин-биотинового комплекса
2.5.2 «Сэндвич»-иммуноанализ биотоксинов с использованием флуоресцентно меченых антител
2.5.3.Определение стафилококковых энтеротоксинов в пищевых продуктах
2.5.4. Экспресс анализ биотоксинов на биочипах, изготовленных на металлизированной подложке
2.6. Флуоресцентные измерения
2.7. Обработка результатов анализа
2.8. Аналитические характеристики системы
2.8.1.Воспроизводимость анализа
2.8.2. Аналитическая чувствительность
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Одновременный количественный анализ пятнадцати биотоксинов
3.1.1. Подбор пар антител для одновременного анализа пятнадцати биотоксинов
3.1.2. Проверка специфичности выбранных пар антител
3.1.3. Разработка одновременного анализа пятнадцати биотоксинов
3.1.4. Аналитические характеристики количественного иммуноанализа пятнадцати биотоксинов на биочипах
3.1.5. Применение зеркальных подложек для сокращения времени одновременного анализа пятнадцати биотоксинов на биочипах
3.2. Экспресс-анализ биотоксинов в формате «один биочип — один образец»

3.3. Практическое применение - разработка прототипа тест-системы для одновременного анализа семи типов стафилококковых энтеротоксинов на
биочипе
3.3.1. Биочип для одновременного анализа семи энтеротоксинов стафилококка
3.3.2. Методика проведения анализа
3.3.3. Аналитические характеристики одновременного количественного иммуноанализа семи типов энтеротоксинов на биочипах
3.3.4. Анализ стафилококковых энтеротоксинов в биологических средах
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

использовании специфичных моноклональных антител к SEB перекрестные реакции с SEC 1 не наблюдались. Кроме того, была оценена способность RAP для быстрого определения токсина в неизвестном образце при помощи измерения начальной скорости взаимодействия, что дало возможность сократить время анализа до 6 минут.
Индивидуальный метод анализа SEB-в молочных продуктах, таких как молоко (2% жирности), шоколадное молоко, йогурт, детское питание и мороженое, предложен Т. Boyle [156]. Анализ проводили при помощи проточного, иммунохроматографа (LFD). Ни с одним продуктом не было получено ложноположительных результатов. Разведение образцов

предотвращало появления хук-эффекта и способствовало капиллярному течению в мембране. Полутвердые' продукты, такие как, мороженое и некоторые йогурты, а также продукты, содержащие загустители, диспергировали в фосфатно-солевом1 буфере (pH 7.2). SEB определяли- в концентрациях от 0.25 до 5 нг/мл, которых достаточно, чтобы вызвать отравление.
Описан метод индивидуального определения- SEB в пищевых продуктах при' помощи хемилюминесцентного иммуносенсора (ECL), основанного1 на золотых наночастицах [157]. Первичные антитела против SEB были иммобилизованы на поверхность золотых наночастиц путем физической адсорбции. Затем смесь наночастиц иммобилизовали на поликарбонатной поверхности. Определение токсина проводили при помощи «сэндвич»-иммуноанализа на поликарбонатной поверхности, используя вторичные антитела и детекцию хемилюминесцентным иммунодетектором (ECL). Сигнал от ECL считывался при помощи CCD камеры или плашечного ридера. Данную систему использовали для определения SEB в буфере и в различных пищевых продуктах (грибы, томаты, мясо для детского питания). Предел определения- был приблизительно 0.01 нг/мл, что в 10 раз чувствительнее, чем традиционный метод ELISA.