Противоопухолевые эффекты модифицированных фрагментов GD2-специфичных антител

• Автор: Доронин, Игорь Игоревич
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 159 с. : ил.

Оглавление
1. Введение
2. Обзор литературы
2.1.1 Ганглиозиды как мишени противоопухолевой терапии
2.1.2 Иммунотерапия с использованием моноклональных антител
2.1.3 Разработка и использование СЭ2-специфичных антител в противоопухолевой терапии
2.1.4 Современные стратегии повышения эффективности СЕ)2-направленной терапии
онкологических заболеваний
2.1.5 Предполагаемые механизмы прямой цитотоксической активности С02-специфичных антител
2.1.6 Модифицированные фрагменты моноклональных антител в терапии онкологических
заболеваний
3. Основная часть
3.1.1 Материалы и методы
4. Результаты и их обсуждение
4.1.1 Выбор клеточной модели для исследования действия 002-специфичных антител и
их фрагментов
4.1.2 Цитотоксические эффекты С02-специфичных антител на опухолевых клеточных линиях
4.1.3 Создание и экспрессия рекомбинантного scFv-фрагмента 0О2-специфичного
антитела 3F
4.1.4 Изучение связывающей способности полученных scFv-фрагментов
4.1.5 Создание гибридомы, продуцирующей специфичные моноклональные антитела к
опухолеассоциированному ганглиозиду GD
4.1.6 Энзиматическое получение фрагментов С02-специфичных моноклональных антител
класса IgM
4.1.7 Энзиматическое получение Fab-фрагментов СП2-специфичпых антител МЕ
4.1.8 Сравнение цитотоксических эффектов Fab-фрагментов антител МЕ361 с
полноразмерными антителами
4.1.9 Пегилирование Fab-фрагментов МЕ
4.1.10 Изучение противоопухолевых эффектов Fab-фрагментов ОЭ2-специфичпых антител,
а также их модифицированных аналогов in vivo
4.1.11 Заключение и выводы
5. Список сокращений
6. Благодарности
7. Список литературы

1. Введение Актуальность проблемы
В России ежегодно диагностируется около 500 тыс. новых случаев онкологических заболеваний, а число умерших от злокачественных новообразований составляет более 280 тыс. человек в год. Эти цифры во многом обусловлены как проблемами ранней диагностики, так и несовершенством существующих методов противоопухолевой терапии. Хирургия, химиотерапия и лучевая терапия далеко не всегда дают положительные эффекты, приводящие к полной регрессии болезни, кроме того, данные способы лечения имеют серьезные побочные эффекты. В связи с этим, в настоящее время во всем мире остро стоят задачи по разработке новых адресных, высокоэффективных и низкотоксичных методов терапии онкологических заболеваний. Одним из таких наиболее перспективных направлений является иммунотерапия с использованием препаратов на основе моноклональных антител, направленных на таргетные опухолевые молекулы.
За последнее десятилетие достигнут колоссальный прогресс в конструировании моноклональных антител и их производных. В настоящее время более 20 противоопухолевых препаратов данного типа применяется в клинической практике, причем за последние пять лет их число удвоилось. Мишенями для иммунотерапии рака могут служить не только белки, но и гликосфинголипиды, в частности ганглиознды. Среди данных молекул наиболее ярко выделяется ганглиозид GD2, гиперэкспрессируемый опухолями различного происхождения, включая нейробластомы, ретинобластомы, меланомы, мелкоклеточный рак легких, остеосаркомы, рабдомиосаркомы, саркомы Юинга. По некоторым данным С02-позитивные опухоли составляют около 10% от общего числа онкологических заболеваний, и для многих из них характерна крайне ограниченная эффективность классических методов терапии.
Применение антител к GD2 дало существенный эффект, выраженный в супрессии опухолевых клеток в экспериментах как in vitro, так и in vivo. Несколько препаратов GD2-специфичных моноклональных антител в настоящее время проходят клинические испытания, которые свидетельствуют в пользу перспективности иммунотерапии в лечении GD2-позитивных опухолей. Однако выявлены побочные эффекты, а именно: жар, боль, сыпь, лихорадка, нейротоксичность, вызванные иммуногенностыо препаратов и гнперактнвацией иммунной системы, что во многом опосредуется Fc-фрагментом моноклональных антител. Кроме того, большинство GD2-no3HTHBHbix новообразований представляют собой солидные опухоли, для которых характерна невысокая противоопухолевая эффективность моноклональных антител, что обусловлено низкой проникающей способностью полноразмерных иммуноглобулинов, характеризующихся большими размерами.

В последнее время появились данные о прямой индукции гибели опухолевых клеток под действием СЭ2-специфичных антител. Важным является то, что цитотоксическая активность моноклональных антител не опосредована классическими иммунными механизмами элиминирования опухолевых клеток, для проведения которых необходим Fc-фрагмент антител. Поскольку Fc-фрагмент в случае GD2-no3HTiiBHbix опухолей определяет ряд побочных эффектов и, возможно, его наличие в структуре иммуноглобулина не является ключевым для положительных противоопухолевых эффектов полноразмерных антител, то открывается новый подход к исследованию С02-связывающих фрагментов антител в качестве индукторов гибели опухолевых клеток. Данные фрагменты, лишенные Fc-фрагмента, имеют потенциальные терапевтические преимущества по сравнению с полноразмерными С02-специфичными антителами, в случае сохранения ими цитотоксических свойств. Так, фрагменты антител, обладая значительно меньшим размером, чем антитела, будут иметь лучшую способность проникновения вглубь солидных опухолей, а также их использование позволит убрать побочные эффекты, обусловленные Fc-фрагментом антител. В настоящее время в мировой литературе нет данных по изучению цитотоксических и противоопухолевых эффектов фрагментов С02-специфичных антител. Таким образом, получение и модификация фрагментов С132-специфичных антител, а также изучение их способности к индукции гибели опухолевых клеток, и исследование их противоопухолевых эффектов, является актуальной задачей и первым шагом к получению нового перспективного инструмента для адресной терапии GD2-позитивных опухолей.
В первой части работы произведена системная оценка цитотоксических эффектов GD2-специфичных антител на различных опухолевых клеточных линиях. Вторая часть работы посвящена получению функционально активных фрагментов С02-специфичных антител. В третьей части работы исследуются противоопухолевые эффекты модифицированных фрагментов С02-специфичных моноклональных антител в системе in vivo.
Цель работы и основные задачи исследования
Цель работы — изучить цитотоксические и противоопухолевые эффекты фрагментов СП2-сиецифичных антител.
Задачи исследования:
1) Доказать, что индукция клеточной гибели под действием 002-специфичпых антител является общим свойством GD2-no3HTUBHbix опухолевых линий.
2) Получить гибридомы, продуцирующие С02-специфичные антитела.
3) Выделить различные С02-связывающие фрагменты антител.

пептидов, мимикрирующих гаиглиозид 002, а также антитела, использованные для их идентификации, представлены в таблице:
Таблица 4. Примеры мимикрирующих пептидов, выделенных при помощи 002-специфичных антител.
Тип антитела Обозначение GD2-мимикрирующих пептидов Последовательность аминокислот
МЕ36.1 Р9 LDVVLAWRDGLSGAS
Р10 GVVWRYTAPVHLGDG
PlOs WRYTAPVHLGDG
14.G2a 47 EDPSHSLGLDVALFM
47-LDA EDPSHSLGLDAALFM
94 RCNPNMEPPRCF
94-12-F/W-AAEGD RCNPNMEPPRCWAAEGD
Qiu с соавторами применили библиотеки, созданные при помощи вектора WSE5, для скрининга 002-мимикрирующих пептидов. Авторы выбрали из данной библиотеки 16 пептидов при помощи 002-специфичных антител МЕ36.1 [78]. Анализ изолированных пептидов показал наличие в основном уникальных последовательностей, отражающий факт, что большое количество пептидов может мимикрировать связывание ганглиозида GD2 с антителами МЕ36.1. Следует отметить, что наблюдались некоторые сходства между пептидами, изолированными при помощи антител МЕ36.1 и BR55-2 (связывающих опухолевый маркер Lewis-Y). В частности, наличие последовательностей WRY и АР в пептиде Р10 (GVVWRYTAPVHLGDG) и WRDG в пептиде Р9 (LDVVLAWRDGLSGAS), которые схожи с последовательностью YRGD, обнаруженной в пептидах, изолированных при помощи BR55-2, что говорит о возможной колокализации GD2 и Lewis-Y на мембране опухолевых клеток.
Использование пептида Р10 в качестве нммуногена совместно с адъювантом QS-21 привело к выработке иммунного ответа у мышей с образованием антител класса IgM, способных связывать ряд ганглиозидов, включая GDlb, GDI a, GD3, GD2 и GM2. При помощи методов молекулярного моделирования было показано, что Р10 связывается с антителами МЕ36.1 при помощи всего лишь двух водородных связей — ТугЗЗ и SerlOO тяжелой цепи. В то время как гаиглиозид GD2 связывается антителами значительно эффективнее, взаимодействуя с ТугЗЗ, His35, Asp50, Asn52, Asn59, SerlOO тяжелой цепи, и Туг93 легкой цепи. Для усиления иммунологической мимикрии ганглиозида GD2, был разработан укороченный пептид PlOs, который значительно эффективнее связывается с антителами МЕ36.1. Показано взаимодействие с ТугЗЗ, Asp50, Asn59, SerlOO тяжелой цепи, и Туг93 легкой цепи. Иммунизация пептидом PlOs