Белки, взаимодействующие с LIM-доменным цитоскелетным белком зиксином в раннем развитии центральной нервной системы шпорцевой лягушки Xenopus laevis

• Автор: Ермолина, Людмила Викторовна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 110 с. : ил.

1. ОГЛАВЛЕНИЕ
2. ВВЕДЕНИЕ
3. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ
3.1 Нейральная индукция и регионализация эмбриональной эктодермы
3.2. Дифференцировка нервной пластинки
3.3. Роль гомеобоксного гена Xanfl в раннем развитии переднего мозга эмбрионов шпорцевой лягушки
3.4. Участие белка Sonic hedgehog в формировании дорсо-вентральной разметки нервной трубки
3.4.1. Основные компоненты сигнального каскада, запускаемого белками семейства Hedgehog
3.5. Цитоскелетный белок зиксин — универсальный регулятор клеточной адгезии и экспрессии генов
3.5.1. Белок зиксин: локализация и гомологи
3.5.2. Молекулярная структура зиксина
3.5.3. Зиксин как компонент клеточных контактов и его роль в регуляции сборки актинового цитоскелета
3.5.4. Механизмы перемещения зиксина между цитоплазмой и ядром
3.5.5. Зиксин как регулятор генной экспрессии
3.6. Дрожжевая двугибридная LexA-система
3.7. Зародыши шпорцевой лягушки Xenopus laevis как экспериментальная модель для изучения молекулярно-генетических механизмов эмбриогенеза
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Поиск белков, взаимодействующих с транскрипционным фактором Xanfl, при помощи дрожжевой двугибридной LexA-системы
4.2. Клонирование полноразмерной последовательности кДНК зиксина Xenopus laevis
4.3. Экспрессия гена зиксина в эмбриональном развитии Xenopus laevis
4.4. Зиксин способен связываться с Xanfl in vivo
4.5. Второй LIM-домен зиксина отвечает за связывание с Engrailed-
подобным репрессорным доменом Xanfl
4.6. Ко-локализация белков Xanfl и зиксина в клетках линии CV-1
4.7. Зиксин подавляет активность транскрипционного репрсссора Xanfl в клетках зачатка переднего мозга зародышей шпорцевой лягушки Xenopus laevis
4.8. Поиск белков, способных взаимодействовать с зиксином в ходе раннего развития шпорцевой лягушки
4.9. Зиксин связывается с белками Ptc2, Ziel и Glil in vivo
5. ВЫВОДЫ
6. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
6.1. Материалы
6.1.1 Реактивы
6.1.2. Ферментные препараты
6.1.3. Лабораторное оборудование
6.1.4. Лабораторные животные
6.1.5. Буферы и растворы
6.1.6. Микробиологические среды
6.1.7. Предоставленные штаммы
6.1.8. Предоставленные плазмиды
6.2. Методы
6.2.1. Амплификация ДНК при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР)
6.2.2. Электрофорез в агарозном геле
6.2.3. Элюция ДНК из агарозного геля
6.2.4. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции
6.2.5. Достройка З'-конца двухцепочечных молекул ДНК
6.2.6. Отщепление выступающего 3'- конца двухцепочечных молекул ДНК
6.2.7. Лигирование молекул ДНК

6.2.8. Трансформация клеток Escherichia coli
6.2.9. Выделение плазмидной ДНК из бактерий Escherichia coli
6.2.10. Изготовление ДНК конструкций
6.2.11. Трансформация плазмидной ДНК в дрожжевые клетки с использованием ацетата лития
6.2.12. Выделение плазмидной ДНК из дрожжей
6.2.13. Изучение белковых взаимодействий в дрожжах с помощью Colony-lift filter assay
6.2.14. Изучение белок-белковых взаимодействий в дрожжах с помощью цветной ферментативной реакции с использованием субстрата ONPG в жидкой среде (Liquid Culture Assay)
6.2.15. Транскрипция in vitro
6.2.16. Получение зародышей шпорцевой лягушки Xenopus laevis
6.2.17. Получение ооцитов шпорцевой лягушки Xenopus laevis
6.2.18. Синтез белков в ооцитах или зародышах Xenopus laevis
6.2.19. Экспрессия клонированных генов в E.coli с использованием IPTG-зависимого промотора
6.2.20. Электрофоретическое разделение белков в денатурирующих условиях в ПААГ
6.2.21. Иммуноблот (Western Blotting)
6.2.22. Изучение белок-белковых взаимодействий в системе in vitro с помощью метода pull down
6.2.23. Изучение белок-белковых взаимодействий в системе in vivo с помощью метода коиммунопреципитации
6.2.24. Блокирование трансляции эндогенных мРНК, кодирующих Xanfl, при помощи микроинъекций синтетических анти-смысловых олигонуклеотидов
6.2.25. Фиксация зародышей
6.2.26. Гибридизация in situ на целых зародышах шпорцевой лягушки

1. простота содержания взрослых особей и возможность при помощи инъекции гонадотропных гормонов получать яйца в заданное время в течение круглого года;
2. зигота (оплодотворенная яйцеклетка) шпорцевой лягушки имеет достаточно большой размер (около 1200 микрон в диаметре);
3. развитие до поздних стадий происходит без существенного изменения общего объема зародыша;
4. быстрый темп развития (при комнатной температуре развитие до завершения нейруляции проходит за два дня);
5. развитие хорошо изучено, составлены таблицы нормального развития (Nieuwkoop P.D., 1956);
6. наличие генетических маркеров.
Перечисленные особенности эмбриогенеза амфибий позволяют легко проводить прижизненные наблюдения за эмбрионами в течение всего их развития и осуществлять различные микрохирургические манипуляции и микроинъекции в ранние эмбрионы синтетических мРНК, плазмидных конструкций, анти-смысловых олигонуклеотидов и т.п. Благодаря тому, что развитие до поздних стадий протекает без существенного изменения общего объема зародыша, можно проводить количественные эксперименты по изучению влияния микроинъецированного материала. Для данного объекта созданы эффективные методики получения трансгенных линий, гибридизации in situ, приготовления гистологических препаратов с применением прижизненных флуоресцентных меток и т.п.
В силу высокого консерватизма базовых механизмов раннего эмбриогенеза у позвоночных, данные, полученные на Xenopus laevis, могут быть легко перенесены на других представителей позвоночных, в том числе и на человека. Подтверждением этому может служить тот факт, что большинство современных знаний о механизмах пространственной организации развития, морфогенезе, взаимной зависимости частей