Новые генно-инженерные белки на основе рекомбинантных антител против TNF

• Автор: Ефимов, Григорий Александрович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 122 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. История открытия TNF

2. Суперсемейство TNF

3. Структура системы TNF-TNFR

4. Функции TNF

5. РОЛЬ TNF В ПАТОГЕНЕЗЕ РЕВМАТОИДНОГО АРТРИТА И ДРУГИХ АУТОИММУННЫХ

ЗАБОЛЕВАНИЙ

6. ТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ БЛОКИРОВКА TNF

7. ПОБОЧНЫЕ ЭФФЕКТЫ И ОГРАНИЧЕНИЯ АНТИ-TNF ТЕРАПИИ
8. Новые подходы и перспективы TNF блокировки
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. получение и характеристика нового верблюжьего однодоменного антитела к TNF
ЧЕЛОВЕКА
Экспрессия и очистка одиодомениого антитела Vhh
Оценка связывания антитела Vhh-11 с TNF человека методом ИФА
Изучение взаимодействия Vhh41 и TNF человека методом поверхностного плазменного
резонанса
Исследования способности Vhh41 блокировать TNF человека
2. Конструирование, получение и характеристика гибридных белков -
флуоресцентных сенсоров TNF
Конструирование генов, кодирующих сенсоры TNF
Экспрессия и очистка флуоресцентных сенсоров TNF
Анализ взаимодействия Vhh41 -К с рекомбинантным TNF
Исследование биологических свойств флуоресцентного сенсора Vhh41-K TNF in vitro и in vivo.
Изучение способности флуоресцентного сенсора связывать TNF in vivo
Прижизненное изучение экспрессии TNFс помощью полученного флуоресцентного сенсора
3. Получение и характеристика одноценочечного анти-tnf антитела
Изучение мышиного моноклонаїьного антитела F
Конструирование и экспрессия одноцепочечного антитела ahT-
Измерение биологической активности одноцепочечного антитела ahT-
4. Получение и характеристика химерного анти-TNF антитела
5. Конструирование, получение и характеристика биспецифических антител А9 и

Конструирование, экспрессия и очистка антител А9 и тА
Взаимодействие антител А9 и тА9 с рекомбинантным TNF человека методом
поверхностного плазменного резонанса
Цитотоксический тест
Цитофлуориметрия
Оценка способности биспецифического антитела А9удерживать TNF человека на
поверхности макрофагов
6. Сравнительная оценка эффективности системной и селективной блокировки
МАКРОФАГАЛЬНОГО TNF
Модель острой гепатотоксичности, индуцированной введением JinC/D-галактозамина
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Получение и характеристика нового рекомбинантного однодоменного антитела, СПЕЦИФИЧЕСКИ СВЯЗЫВАЮЩЕГОСЯ с TNF человека, но не блокирующего его
биологическую активность
Создание генетической конструкции, кодирующей рекомбинантное однодоменное антитело Vhh
, Экспрессия и очистка рекомбинантного однодоменного антитела Vhh4]
Анализ взаимодействия однодоменного антитела Vhh41 с TNF человека
Анализ способности антитела Vhh41 блокировать биологическую активность TNF человека.
2. КОНСТРУИРОВАНИЕ, получение и характеристика молекулярных СЕНСОРОВ TNF для ПРИЖИЗНЕННОГО ИЗУЧЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ TNF 1IA ОСНОВЕ ОДНОДОМЕННЫХ РЕКОМБИНАНТНЫХ
АНТИТЕЛ И КРАСНОГО ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО БЕЛКА
Получение генетических конструкций, кодирующих флуоресцентный сенсор TNF Vhh41-K и
контрольные гибридные белки
Экспрессия и очистка флуоресцентного сенсора TNF Vhh41-K
Анализ взаимодействия флуоресцентного сенсора TNF Vhh41-K с рекомбинантным TNF мыши
и человека
Исследование биологических свойств флуоресгіентного сенсора TNF Vhh41-K in vitro и in vivo.
Изучение способности флуоресцентного сенсора связывать TNF in vivo
Прижизненное изучение экспрессии TNFс помощью полученного флуоресгіентного сенсора
3. ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА РЕКОМБИНАНТНОГО ОДНОЦЕПОЧЕЧНОГО АНТИТЕЛА,
БЛОКИРУЮЩЕГО БИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ TNF
Измерение активности мышиного моноклонального антитела F
Конструирование одноцепочечного антитела на базе вариабельных фрагментов легкой и
тяжелой цепей мышиного моноклонального антитела F
Измерение активности одноцепочечного антитела ahT-
4. Разработка и анализ химерного антитела против TNF человека
Сравнение кинетики взаимодействий химерного антитела 13239 и инфликсимаба с рекомбинантным TNF человека
Сравнение нейтрализующей активности химерного антитела 13239 с активностью
инфликсимаба in vitro
Анализ активности химерного антитела 13239 in vivo
5. КОНСТРУИРОВАНИЕ, ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА СЕЛЕКТИВНОГО БЛОКАТОРА TNF,
ПРОИЗВОДИМОГО КЛЕТКАМИ МОНОЦИТАРНО-МАКРОФАГАЛЬНОГО РЯДА
Молекулярное клонирование, экспрессия и очистка биспецифических антител
Взаимодействие антител А9 и тА9 с рекомбинантным TNF человека
Блокировка антителами А9 и тА9 TNF-зависимой цитотоксичности in vitro
Анализ связывания антител А9 и тА9 с поверхностью макрофагов через взаимодействие с
поверхностной молекулой F4/
Удержание эндогенно продуцируемого TNF человека на поверхности макрофагов биспецифическим антителом А
6. ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ ЗНАЧИМАЯ СЕЛЕКТИВНАЯ БЛОКИРОВКА TNF, ПРОИЗВОДИМОГО КЛЕТКАМИ
МОНОЦИТАРНО-МАКРОФАГАЛЬНОГО РЯДА IN VIVO
Сравнительная оценка эффективности направленной блокировки TNF, производимого клетками моноцитарно-макрофагалыюго ряда, и системной блокировки TNF в модели острой
гепатотоксичности
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
БЛАГОДАРНОСТИ

фотометре при длине волны 450 нм.
Полученные значения оптической плотности обрабатывались с помощью программы GraphPad Prism.
• Поверхностный плазмонный резонанс.
Измерения кинетики взаимодействия Vhh41-K. и контрольного флуоресцентного гибридного белка mVhh41-K с рекомбинантными TNF человека и мыши проводилось методом поверхностного плазмонного резонанса на приборе Proteon XPR36 (BioRad). Рекомбинантный TNF человека был иммобилизован по амино-группе на поверхности биочипа с модифицированной альгинатной полимерной поверхностью (Bio-Rad 1 Тб-5011) в концентрациях 450, 300 и 200 нМ, а затем Vhh41-K или mVhh41-K были нанесены на чип в качестве аналита в концентрации 1 мкМ или 500 нМ. Рекомбинантный TNF мыши был аналогичным образом иммобилизован в концентрации 100 нМ, а затем Vhh41-K был нанесен в качестве аналита в концентрации 1,5 или 1 мкМ или 750 или 500 нМ. Анализ полученных сенсограмм проводился в программе ProteOn Manager (Bio-Rad) с использованием модели Ленгмюра.
Исследование биологических свойств флуоресцентного сенсора Vhh41-K TNF in vitro и in vivo.
• Измерения профиля флуоресценции.
Профиль флуоресценции измерялся на флуоресцентном спектрофотометре Varian Cary Eclipse (Agilent). Данные обрабатывались в программе GraphPad Prism.
• Цнтотоксический тест.
Анти-TNF активность Vhh41-K и блокирующего сенсора TNF измерялась методом цитотоксического теста на линии L929 по протоколу, аналогичному описанному выше.
• Стабильность in vivo.
Мышам линии C57BL/6 внутривенно вводили 200 мкг флуоресцентного сенсора TNF Vhh41-K. Образцы тканей и крови (из ретро-орбитального синуса и сердца) были взяты через 3,5,8,11 и 28 часов после введения препарата.
К образцам ткани добавляли охлажденный буфер RIPA (50 mM HEPES; 1 тМ ЭДТА; 0,7% дезоксихолевой кислоты; 1% детергента NP-40; 0,5 М LiCl), к которому были предварительно добавлены ингибиторы протеаз (Complete Protease Inhibitors Cocktail, Roche), и гомогенизировали на льду. Полученные гомогенаты инкубировали полчаса на льду и центрифугировали на 10,000 х g при 4° С в течение 10 минут. В