Исследование протекторных свойств нейротрофинов при угнетении синаптической пластичности в гиппокампе бета-амилоидным пептидом

• Автор: Иванов, Андрей Дмитриевич
• Шифр специальности: 03.03.01, 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 82 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Синтез, процессинг и транспрт нейротрофинов

1.2. Рецепторы нейротрофинов

1.3. Фактор роста нервов (NGF)

1.4. Нейротрофический фактор мозга (BDNF)

1.5. Моделирование патологических условий с помощью бета-амилоида

1.6. Заключение

ГЛАВА 2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Создание генно-инженерной конструкции для обеспечения оверэкспрессии NGF и BDNF в гиппокампе
2.1.1. Получение генов NGF и BDNF методом полимеразной цепной реакции
2.1.2. Клонирование ПЦР-продуктов в «служебный» p-GEM-T вектор
2.1.3. Подготовка генов NGF и BDNF к клонированию в рабочий вектор
2.1.4. Подготовка рабочего вектора к клонированию
2.1.5. Лигирование генов NGF и BDNF в вектор pCMV
2.1.6. Трансформация компетентных клеток и выделение плазмидных ДНК
2.1.7. Рестрикционный анализ
2.1.8. Сборка вирусных систем для обеспечения оверэкспрессии NGF и BDNF. .
2.2. Исследование влияния оверэкспрессии NGF и BDNF на параметры LTP в
гиппокампе крыс в нормальных и патологических условиях
2.2.1. Содержание животных
2.2.2. Инъекция лентивирусных суспензий в зубчатые фасции гиппокампов экспериментальных животных
2.2.3. Приготовление переживающих срезов мозга
2.2.4. Инкубация срезов в растворе ß-амилоидного пептида
2.2.5. Перемещение срезов в экспериментальную камеру и установка электродов.
2.2.6. Поиск оптимального сигнала и подбор рабочей интенсивности стимула
2.2.7. Регистрация ВПСП
2.2.8. Парная стимуляция
2.2.9. Тетанизация
2.2.10. Инкубация срезов в растворах ингибиторов киназных каскадов..

2.2.11. Обработка результатов
2.3. Оценка эффективности лентивирусной трансдукции
2.3.1. Визуализация трансдуцированных клеток
2.3.2. Количественная оценка изменения концентраций N0? и В Б N7 в гиппокампе экспериментальных животных вследствие лентивирусной трансдукции
2.4. Заключение
ГЛАВА 3. ЭФФЕКТИВНОСТЬ ЛЕНТИВИРУСНОЙ
ТРАНСДУКЦИИ
3.1. Локализация трансдуцированных клеток
3.2. Увеличение концентрации N07 и ВБ№ вследствие вирусной трансдукции.
3.3. Заключение
ГЛАВА 4. ДОЛГОВРЕМЕННАЯ ПОТЕНЦИАЦИЯ НА ФОНЕ
ОВЕРЭКСПРЕССИИ НЕЙРОТРОФИНОВ В НОРМАЛЬНЫХ УСЛОВИЯХ
4.1. Контрольные группы
4.2. Группы с оверэкспрессией нейротрофинов
4.3. Парное отношение и пресинаптический компонент пластичности.
4.4. Заключение
ГЛАВА 5. ДОЛГОВРЕМЕННАЯ ПОТЕНЦИАЦИЯ НА ФОНЕ
ОВЕРЭКСПРЕССИИ НЕЙРОТРОФИНОВ В ПАТОЛОГИЧЕСКИХ УСЛОВИЯХ
5.1. Подавление посттетанической потенциации бета-амилоидным пептидом
5.2. Различия в нейропротекторном эффекте N07 и ВБ№
5.3. Заключение
ГЛАВА 6. ВОЗМОЖНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕАЛИЗАЦИИ
НЕЙРОПРОТЕКТОРНОГО ЭФФЕКТА ФАКТОРА РОСТА НЕРВОВ
6.1. Каскад фосфатидилинозитол-3-киназы
6.2. Каскад активируемой митогенами протеин-киназы
6.3. Каскад фосфолипазы-С
6.3. Заключение

ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Ар - бета-амилоидный пептид
ВГТСП - возбуждающий постсинаптический потенциал
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
РНК - рибонуклеиновая кислота
ПНС - периферическая нервная система
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ЦНС - центральная нервная система
ACSF - artificial cerebrospinal fluid, искусственная цереброспинальная жидкость
Akt (РКВ) - протеин киназа В
АМРА-рецептор - ионотропный рецептор глутамата, селективно связывающий а-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовую кислоту Arc - регулируемый активностью ассоциированный с цитоскелетом белок BDNF - brain-derived neurotrophic factor; нейротрофический фактор мозга СА1 - cornu ammonis 1; поле СА1 гиппокампа СаМКП - Са2+/кальмодулин-зависимая киназа II
CIAP - calf intestine alkaline phosphatase; щелочная фосфатаза кишечника теленка
CMV - цитомегаловирус
CREB - cAMP response element-binding protein; белок связывания регуляторного элемента цАМФ
DG - зубчатая фасция гиппокампа
GFP - green fluorescent protein; зеленый флуоресцентный белок IP3 — инозитол-трифосфат
1RES — internal ribosome entry site; внутренний участок посадки рибосомы

2.2.11. Обработка результатов.
Основным оцениваемым параметром во всех экспериментах была выбрана амплитуда ВПСП. Амплитуды ВПСП измерялись полуавтоматически программой ClampFit 10.2. Результаты подсчета подвергали визуальной проверке, в ходе которой ВПСП, искаженные явными артефактами, исключали из подсчета.
Для каждого среза среднюю амплитуду ВПСП до тетанизации принимали за 100% и с ней далее сравнивали амплитуды всех ВПСП.
В рамках каждой группы производилось вычисление средних значений амплитуды ВПСП, стандартного отклонения и ошибки среднего для каждой временной точки с помощью программы MS Excel 2003. Построение графиков производилось с помощью программы OriginPro 8. Статистическая обработка результатов включала в себя проведение однофакторного дисперсионного анализа и Т-теста Стьюдента с помощью программы MS Excel 2003.
2.3. Оценка эффективности лентивирусной трансдукции.
Параллельно с электрофизиологическими экспериментами, часть инъецированных животных была использована в качестве материала для оценки эффективности лентивирусной трансдукции биохимическими методами.
2.3.1. Визуализация и локализация трансдуцированных клеток.
Перед началом количественных биохимических исследований, одно животное из каждой группы получало системную анестезию 8% раствором хлоралгидрата и подвергалось транскардиальной перфузии по стандартному протоколу. Далее, мозг животного извлекали и дополнительно фиксировали в 4% растворе параформальдегида в фосфатно-солевом буфере (PBS) в течение суток.