Разработка системы экспрессии генов на основе метилотрофных дрожжей Komagataella kurtzmanii

• Автор: Тюрин, Олег Владимирович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 122 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ

1.1 Использование дрожжей для продукции рекомбинантных белков. Общие аспекты

1.2 Использование метилотрофных дрожжей для гетерологичной экспрессии

1.3 Pichia pastoris. Обзор основных преимуществ и ряд ограничений на применение в производстве

1.4 Современная классификация видов рода Pichia / Komagataella

1.5 Штаммы Komagataella phaffii, используемые в биотехнологии

1.6 Метаболический путь метанола в дрожжах рода Komagataella / Pichia

1.7 Векторы, использумые для гетерологичной экспрессии в дрожжах

1.8 Организация секреции рекомбинантных белков в клетках Komagataella.

Сигнальные последовательности
1.9 Промотор АОХ1. Регуляция промотора АОХ1 посредством активатора трансктипции Mxrlp
1.10 Альтернативные промоторы, используемые для гетеролологичной
экспрессии GAP, FLD
1.11 Штаммы-продуценты на основе K.phaffii
1.12 Выводы из обзора источников и планирование работы
2. РАЗРАБОТКА ЭКСПРЕССИОННОЙ СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ ШТАММА Komagataella kurtzmanii Y727 (ВКПМ)
2.1 Выбор штамма
2.2 Исследование таксономических и основных фенотипических характеристик штамма ВКПМ Y
2.3 Морфологические, физиологические и ростовые характеристики
2.4 Клонирование и анализ нуклеотидной последовательности промотора
АОХ1 штаммов K.kurtzmanii Y-727 и K.phaffii GS
2.5 Сравнительное исследование регуляции активности промоторов АОХ1, в клетках штаммов Y-727 и GS
2.6 Клонирование и анализ нуклеотидной последовательности промоторов

GAP штаммов K.kurtzmanii Y-727 K.phaffii GS
2.7 Сравнительное исследование регуляции активности промоторов АОХ1, GAP в клетках штаммов У-121 и GS
3. ПОЛУЧЕНИЕ АУКСОТРОФНЫХ МУТАНТОВ
3.1 Получение штамма K.kurtzmanii Y727ura3mut
3.2 Получение штамма K.kurtzmanii Y727 ura3mulhis4A
3.3 Получение штамма K.kurtzmanii Y727his4A
3.4 Получение штамма K.kurtzmanii Y727arg4Ahis4A
3.5 Получение штамма К. kurtzmanii Y727ade2Ahis4A
3.6 Конструирование экспрессионных векторов
3.6.1 Базовый вектор Ty-URA3-AOXl
3.6.2 Базовый вектор pPH93-HIS4-AOXl
3.7 Оптимизация протокола трансформации
4. ПОЛУЧЕНИЕ ШТАММОВ-ПРОДУЦЕНТОВ НА ОСНОВЕ
К. kurtzmanii Y-
4.1 Получение штамма K.kurtzmanii Y-727his4A/ рРН93-АОХ1 Y727-HSA -продуцента человеческого сывороточного альбумина
4.2 Получение продуцента внутриклеточного белка поверхностного антигена вируса гепатита В
4.3 Получение продуцента рекомбинантного эндотелиального фактора роста (VEGF)
4.4 Оценка эффективности системы экспрессии в условиях ферментации в биореакторе
5.1 Поиск альтернативного индуктора промотора АОХ
5.2 Исследование механизма индукции промотора АОХ
ВЫВОДЫ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
6. МАТЕРИАЛЫ
7. МЕТОДЫ
7.1 Условия культивирования E.coli
7.2 Методы генной инженерии
7.3 Культивирование дрожжей
7.4 Методы работы с белками
7.5 Выделение и очистка VEGF
7.6 Конструирование плазмид
7.6.1 Конструирование плазмид pINT-G418-AOXl Y727-LacZ;
pINT-G418-AOXlGS1 ы-LacZ
7.6.2 Конструирование плазмиды pURA3del
7.6.3 Конструирование плазмиды pHIS4del
7.6.4 Конструирование плазмиды pARG4del
7.6.5 Получение ПЦР продуктов для комплементации мутации в гене URA
7.6.6 Конструирование плазмиды pADE2del
7.6.7 Конструирование базового вектора Ty-URA3-AOXl
7.6.8 Конструирование базового вектора pPH93-H!S4-AOXl
7.6.9 Конструирование плазмиды рРН93-АОХ1 Y727-HSA и
pPH93-AOXlGS,i5-HSA
7.6.10 Конструирование плазмиды pINT-G418-GAPY727-INU, pINT-G418-АОХ1Y727-INU и pINT-G418-GAPGSi,5lNU,
pINT-G418-АОХ1GS |, 5INU
7.6.11 Конструирование плазмид pPH93-AOXlGSn5-HbsAg и
pPH93-AOXlY727-HBsAg
7.6.12 Конструирование плазмид pINT-fldA-AOXlY727-LacZ;
pINT-fld А-АОХ1GS 15-LacZ
7.6.13 Конструирование плазмиды pINT-AOXlY727-VEGFnib
7.7 Получение модифицированных штаммов и штаммов-продуцентов
7.7.1 Получение штаммов продуцентов:
К. kurtzmanii Y-727/pINT-AOXlY727-LacZ ;
K.phaffii GS 115/plNT-АОХ 1GS, irLacZ
7.7.2 Получение штаммов-продуцентов человеческого сывороточного
альбумина
7.7.3 Получение штаммов-продуцентов инулазы
7.7.4 Получение продуцентов HBsAg

формах : VEGFm, VEGF145, VEGF,«, VEGFI65, VEGFl65b, VEGFlg3, VEGF189, VEGF206, получаемых в результате альтернативного сплайсинга мРНК, которая состоит из 8-ми экзонов [97]. VEGF влияет на развитие новых кровеносных сосудов (ангиогенез) и выживание незрелых кровеносных сосудов (сосудистая поддержка), связываясь с двумя близкими по строению мембранными тирозинкиназными рецепторами (рецептором-1 VEGFR-1 и рецептором-2 VEGFR-2) и активируя их [98]. Эти рецепторы продуцируются клетками эндотелия стенки кровеносных сосудов [99]. Связывание VEGF с этими рецепторами запускает сигнальный каскад, который в конечном итоге стимулирует рост эндотелиальных клеток сосуда, их выживание и пролиферацию [100]. Fla основании проведенных наблюдений было показано, что многие опухоли экспрессируют VEGF в условиях гипоксии, и что он чрезвычайно важен для развития и поддержания сосудистого русла опухоли, которое, в свою очередь, способствует росту и метастазированию опухоли [101]. Существует 2 вида каждой изоформы - а и Ь, Различие 6-ти С-концевых аминокислот обуславливает принадлежность к виду а или Ь. Считалось, что VEGFxxxa обладает антиогенной активностью, в то время как антагонист VEGFxxxb - обладает антиангиогенной активностью. Но в последних работах было показано, что обе формы обладают ангиогенной активностью [105].
В аспекте медицинского применения VEGF рассматривают в качестве стимулятора ангиогенеза и локальной васкуляризации костных и хрящевых тканей при трансплантации [102].
Актуальность данной задачи послужила основанием для создания продуцента сскретируемого рекомбинантного VEGF на основе штамма ВКПМ Y-727. Недавно было показано, что биологически активная димерная форма VEGF может быть получена в результате секреции в клетках дрожжей K. phaffii [103]. В настоящей работе в качестве объекта для гетероэкспрессии была выбрана изоформа VEGFm [104]. Данная форма получается в результате альтернативного сплайсинга мРНК и выщепления с 5-го по 7-ой экзоны. Таким образом, получается изоформа, менее подверженная протеолизу, поскольку в пределах 5-го экзона находится сайт узнавания плазмина матриксных металлопротеаз, что сказывается на продолжительности жизни активного белка [104]. Кроме того, отсутствие гепарин-связывающего домена,