Взаимодействие гетероаренантрацендионов с G-квадруплексами ДНК-противоопухолевой мишенью

• Автор: Ильинский, Николай Сергеевич
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 138 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы

Цель и задачи исследования

Научная новизна работы

Практическая значимость исследования

Апробация и реализация результатов работы

Материалы и методы

§ 1. Материалы

§2. Приготовление образцов

§3. Абсорбционная спектроскопия

§4. Флуоресценция
§5. Круговой дихроизм
§6. Построение изотерм связывания лигандов с ДНК
§7. Электрофоретическая подвижность в геле (ЕМБА)
Публикации
Структура и объём работы
ГЛАВА 1. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МАЛЫХ МОЛЕКУЛ С ДНК-МИШЕНЯМИ
1.1. Направленное лечение опухолевых заболеваний
1.2. С-квадруплексы нуклеиновых кислот как терапевтическая мишень
§1. Теломераза как терапевтическая мишень
§2. Подавление гиперэкспрессии онкогенов губительно для опухолевой
клетки и возможно через стабилизацию в-квадруплексов
§3. Уникальная структура в-квадруплекса делает возможным создание
селективных к нему препаратов
§4. Множественность потенциальных квадруплекс-образующих последовательностей в геноме и существование О-квадруплексов в клетках человека обосновывает их важность как терапевтической мишени
1.3. Характеристики производных антрахинона как противоопухолевых соединений
§ 1. Противоопухолевые лиганды, действующие на ассоциированные с ДНК процессы, производят действие на опухолевые клетки с некоторой
предпочтительностью
§2. Квадруплексные лиганды: «магическая пуля», требования к
химической структуре и биологическим активностям
§3. Производные антрахинона как квадруплексные лиганды
ГЛАВА 2. МЕХАНИЗМ СВЯЗЫВАНИЯ
ГЕТЕРОАРЕНЕАНТРАЦЕНДИОНОВ С ДНК
2.1. Физические характеристики лигандов
2.2. Связывание с двух цеп очечной ДНК
§ 1. Определение параметров связывания
§2. Необычный тип связывания с двухцепочечной ДНК

2.3. Взаимодействие с теломерным G-квадруплексом
§1. Оценка параметров связывания по спектрам поглощения при
образовании комплекса лиганда с теломерной ДНК
§2. Разрушение гетероаренеантрацендионами G-квартетов в теломерном
ДНК G-квадруплексе в присутствии ионов натрия
§3. Структурные особенности комплексов гетероаренантрацендионов с теломерным G-квадруплексом ДНК в присутствии ионов калия
2.4. Взаимодействие с G-квадруплексами из промоторов онкогенов cMYC, cKIT
§ 1. Нарушение стэкинга и образование агрегатов G-квадруплексов.
§2. Кинетика реакций спаривания квадруплекс-образующей и
комплементарной ДНК из промотора cMYC онкогена
Выводы главы
ГЛАВА 3. ПОИСК СЕЛЕКТИВНЫХ КВАДРУПЛЕКСНЫХ ЛИГАНДОВ НА ОСНОВЕ ГЕТЕРОАРЕНАНТРАЦЕНДИОНОВ
3.1. Оценка констант взаимодействия лиганд-ДНК методом тушения соединениями флуоресценции метки, пришитой к теломерному G-квадруплексу
§1. Тушение флуоресцеина лигандом в растворе и определение константы
связывания
§2. Тушение антратиофендионами флуоресценции флуоресцеина, ковалентно связанного с Gtel22: зависимость Кь от типа иона и pH
3.2. Сравнение аффинностей методом вытеснения лигандом из G-квадруплекса флуоресцирующего интеркалятора (G4-FID)
3.3. Выявление структурных элементов гетероаренантрацендионов, значимых для сродства и селективности к G-квадруплексу, методом плавления по FRET
§1. Круговой дихроизм Gtel22 и лигандов в ЮмМ КС1: разрушение
квартета
§2. Тушение антратиофендионами флуоресценции FAM не препятствует
регистрации стабилизационного эффекта для Gtel-DA
§3. Выбор концентраций лигандов, дуплексной ДНК
§4. Оценка констант связывания по стабилизационному эффекту
§5. Влияние структуры гетероаренантрацендионов на сродство и селективность к G-квадруплексу
3.4. Построение корреляций структуры соединений и биологического
действия
Выводы главы
ВЫВОДЫ
БИБЛИОГРАФИЯ
Опубликованные работы по теме диссертации
Список литературы
Благодарности
ВВЕДЕНИЕ Актуальность работы
Опухолевые заболевания уносят около 1.5 миллионов человеческих жизней в мире ежегодно, входят в десятку самых частых причин смертности. Антрациклиновые производные, к которым относятся митоксантрон, доксорубицин, являются одним из основных классом веществ для противоопухолевой химиотерапии. Недостаточная селективность соединений приводит к повышенной органотоксичности. Для уменьшения побочного действия необходимо повышать аффинность лигандов к мишеням, критичным преимущественно для жизнедеятельности опухолевых клеток.
Одной из таких мишеней является в-квадруплекс ДНК. Стабилизация теломерного в-квадруплекса малыми молекулами приводит к ингибированию активности рибонуклеопротеина теломеразы, работающего в большинстве опухолевых и неактивного в дифференцированных здоровых клетках [1]. Стабилизация промоторных О-квадруплексов позволяет подавить гиперэкспрессию онкогенов [2]. С-квадруплексы - одна из значимых мишеней для направленного лечения онкозаболеваний [3].
Другая проблема, снижающая эффективность химиотерапии, состоит в развитии в опухолевых клетках лекарственной устойчивости. Действие на несколько клеточных процессов является одним из признанных способов преодоления резистентности [4]. Поэтому важно оптимизировать структуру антрахинонов для действия на С-квадруплексы, что в совокупности с ингибированием топоизомеразы, свойственным для антрахинонов, может способствовать увеличению активности соединений против устойчивых линий клеток.
Перспективным классом для поиска противоопухолевых веществ являются линейные гетероаренантрацендионы, на основе которых в НИИ ИНА им. Г.Ф. Гаузе РАМН получен ряд препаратов, блокирующих рост опухолевых клеток, включая линии с активированными механизмами

ядерный магнитный резонанс (ЯМР) [156; 157]. Интересно, что кроме какого-то одного основного типа связывания, молекулы могут иметь альтернативный способ ассоциации, характеризующийся другими энергетическими параметрами [9; 158].
Стэкинг-контакт с внешними С-квартетами. Теломестатин (№1 в
таблице 1-1) (показано по ЯМР для аналога Ь2Н2-6М(2)ОТЕ) [159]) и фторированный полициклический метилакридин БНР84 (№2) (ЯМР, РБВ Ш ШМ2 [160]) - это лиганды, взаимодействующие с квадруплексом только посредством стэкинга. Оба соединения проявляют терапевтический эффект в экспериментах на животных. Высокая избирательность этих соединений -следствие оптимального стэкинга с Ст-квартетом. Теломестатин - один из самых селективных квадруплексных лигандов также благодаря своей нейтральности. Однако сложность его выделения и слабая растворимость заставляют исследователей синтезировать искусственные аналоги (например, НХБУ, см. таблицу 1-1), что также непросто [161].
Бороздочное связывание. Известный дуплексный бороздочный лиганд дистамицин А (рис. 1-7а) исследован на аффинность и тип связывания с О-квадруплексом. Методом ЯМР сначала собрали свидетельства в пользу бороздочного типа связывания с тетрамолекулярным теломерным квадруплексом последовательности [с1(ТОСЮОТ)]4 [162], хотя впоследствии также показали, что дистамицин может образовывать стэкинг с внешними О-тетрадами [163]. Метод плазмонного поверхностного резонанса (НИР) выявил слабое сродство к внутримолекулярному теломерному квадруплексу (Кь < 105 М *), значительно более низкое, чем к двойной спирали ДНК [164].