Адаптивная иммунность к бактериофагам за счет действия CRISPR системы Escherichia coli

• Автор: Пугач, Ксения Сергеевна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 101 с. : ил.

Оглавление
Список сокращений
Обзор литературы
Трансформация
Конъюгация
Трансдукция
Лизогенная конверсия
Бактериофаги и микроэволюция бактерий
CRISPR системы иммунитета
Распространение и структура CRISPR кассет
Cas белки
Механизм действия CRISPR систем
Адаптация
Экспрессия
Интерференция
Заключение
Введение
Материалы и методы
Бактериальные штаммы
Плазмиды
Питательные среды

Селективные антибиотики
Трансформация клеток Escherichia coli
Выделение плазмиды
Рестрикция

Извлечение фрагментов ДНК из агарозы
Лигирование ДНК
Оценка активности предполагаемого промотора
Обработка ДНКазой
Обратная транскрипция
5' RACE
Транскрипция in vitro
Секвенирование
Сайт-направленный мутагенез
Выделение РНК
Мечение олигонуклеотидов
Нозерн-блот для коротких РНК
Нозерн-блот длинных РНК
Результаты и обсуждение
Детекция коротких РНК, соответствующих кассетам CRISPR I, CRISPR II
и CRISPR III E. coli K12
Увеличение количества CRISPR РНК в KEIO-мутантах связано с повышенной экспрессией белка CasE
Определение положения промоторов CRISPRI и CRISPR II кассет
Экспериментальная система для изучения встраивания новых
CRISPR спейсеров
Определение последовательности РАМ для E. coli К12
Определение набора Cas белков, необходимых для встраивания новых
спейсеров
Встраивание новых спейсеров происходит в клетках с делецией
гена hns
Выводы
Список публикаций по теме диссертации
Список цитируемой литературы
Приложение
Приложение
Приложение

CRISPR/Cas локусы Streptococcus pyogenes относятся к Группе II по классификации Makarova и сотр. В геноме этого микроорганизма отсутствуют гены casô, casôf (csy4) и casôe (casE, cse3), ответственные за процессинг пре-крРНК в других системах. Группой под руководством Charpentier было обнаружено, что процессинг пре-крРНК в этой системе осуществляет белок Cas9 (Csnl, Csxl2) в комплексе с клеточной РНКазой III и малой некодирующей РНК tracrRNA [105]. Молекулы tracrRNA комплементарно связываются с последовательностями повторов в пре-крРНК, а РНКаза III в присутствии Cas9 разрезает дуплекс с образованием фрагментов CRISPR РНК длиной 66 нт, содержащих последовательность спейсера, фланкированную повторами. Эти фрагменты затем процессируются с образованием зрелой крРНК длиной 39-42 нт (Рис. 3). Механизм этого более глубокого процессинга пока не известен.