Структурно-функциональные исследования пептидомиметика N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутамина, поиск молекулярных мишеней

• Автор: Савинов, Георгий Владимирович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 110 с. : ил.

Содержание

1. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

2. ВВЕДЕНИЕ
3. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ОСНОВНЫЕ СЕНСОРЫ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ РЕАКЦИЙ И РЕАКЦИЙ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА

3.1 TOLL-ПОДОБНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ

3.1.1 Структура

3.1.2 Лиганды TLR

3.1.3 Экспрессия TLR и чувствительность к стимуляции лигандами TLR различных субпопуляций мышиных В-клеток

3.1.4 Клеточные мишени стимуляции TLR в человеческих В-клетках

3.1.5 TLR-иидуцированная секреция цитокинов В-лимфоцитами

3.1.5 Влияние на дифференцировку Т-клеток посредством TLR активации в антиген-презентирующих клетках (АРС)
3.1.6 Прямая активация TLR в CD4+ Т-эффекторных клетках индуцирует
констимуляцию
3.1.7Влияние направленной TLR-активации на регуляционные Т-клетки
(Treg)
3.1.8 Адъювантная активность
3.2 БЕЛКИ СЕМЕЙСТВА NLR
3.3 БЕЛОК YB-
3.3.1 Структура белка YB-
3.3.2 Участие белка YB-1 в воспалительных заболеваниях
3.3.3 Участие белка YB-1 в онкогенезе
4. МЕТОДИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
4.1 Реактивы и реагенты
4.2 Среды и растворы
4.3 Структура праймеров
4.4 Штаммы E. coli и клеточные линии
4.5 Методика тестирования адъювантной активности RN-пептида
4.6 Выделение мононуклеарных клеток
4.7 Измерение продукции лимфокинов лимфоцитами периферической крови человека
4.8 Выделение РНП
4.9 Выделение полисом, синтезирующих белки с высоким сродством к RN-пептиду
4.10 Синтез кДНК
4.11 Амплификация ДНК
4.12 Рестрикция кДНК и лигирование с вектором
4.13 Лигирование
4.15 Получение электрокомпетентных клеток Е. coli
4.16 Электропорация
4.17 Первичный анализ библиотеки методом скрининга на чашках
4.18 Выделение плазмиды
4.19 Рестрикция
4.20 Получение одноцепочечных Fv фрагментов антител (scFv) против YB-
4.21 Определение Kd
4.22 Конкурентный анализ связывания RN-пептида и ГМДП с YB-1
4.23 Western блот
4.24 Выделение РНК с помощью Trizol
4.25 Измерение уровня экспрессии NF-KB
4.26 Получение поликлональных антител против NOD
4.27 Получение мышиных моноклональных антител к белку YB-
4.28 Подготовка дендритных клеток костного мозга
4.29 Определение внутриклеточной локализации YB-1 и NOD
5. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
5.1 Определение структур RN-пептида, необходимых для проявления биологической активности с помощью укороченных вариантов RN-пептида
5.2 Данные Ala-scan и проверка адъювантной активности
5.3 Анализ адъювантной активности RN-пептида
5.4 Индукция секреции лимфокинов лимфоцитами периферической крови человека RN-пептидом и ГМДП в разных концентрациях
5.5 Поиск белка, взаимодействующего с ГМДП
5.6 Данные анализа первичной структуры
5.7 Определение Kd комплекса RN-пептида с белком YB-1 и проведение конкурентного анализа
5.8 Изменение уровня экспрессии белков NFkBl, NFkB2 и NOD2 в ответ на добавление RN-пептида, ГМДП и YB-1 в культуральную среду
5.9 Анализ внутриклеточной локализации ГМДП, YB-1 и NOD
6. ВЫВОДЫ:
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
anti-PC - антифосфохолиновый
ASC - апоптоз-ассоциированный крапчато-подобный белок CpG - 2'-дезоксирибоцитидин-фосфат-гуанозин CpG-ODN - CpG-содержащие олигодезоксинуклеотиды CSR - переключение субкласса иммуноглобулинов dsRNA - двухцепочечные РНК
GPI-mucin — гликозилфосфатидилинозитол-связывающий муцин-подобный гликопротеин
HIV - вирус иммунодефицита человека (ВИЧ)
IgM - иммуноглобулин М
INF-y - интерферон-у
LBP - LPS-связывающий белок
LPS - липополисахариды
LRR — лейцин-богатые повторы
LTA — летальный токсин Bacillus anthracis
MD-2 — лимфоцитарный антиген
MDP - мурамилдипептид
meso-DAP - y-D-глутамил-мезо-диаминопимелиновая кислота
MyD88 — белок первичного ответа дифференцировки миелоидных клеток
MZ В-клетки - В-клетки краевой зоны селезенки
NBD - нуклеотид-связывающий домен
NK-клетки - натуральные киллеры
NLR - нуклеотид связывающие домены, содержащие лейцин-богатые повторы
NOD2 - нуклеотид-связывающий домен олигомеризации 2 PGN - пептидогликаны РКВ - протеин киназа В

3.3 БЕЛОК YB-
3.3.1 Структура белка YB-
Белок YB-1 (Y-box-связывающий белок 1) принадлежит к доменному семейству белков холодового шока. Белки холодового шока обладают высокой степенью филогенетической консервативности. В самом деле, Y-бокс связывающие белки являются одними из наиболее эволюционно консервативных белками, связывающими нуклеиновые кислоты. В целом гомология аминокислотных последовательностей центрального домена холодового шока (CSD) у прокариот и эукариот составляет более 44% [104, 105]. Белок может быть разделен на три области: аланин/пролин-богатый N-концевой участок; центральный CSD , и С-концевой области, состоящей из чередующихся областей положительно и отрицательно заряженных аминокислотных остатков (где преобладают основные или кислые аминокислотные остатки). Каждый заряженный участок домена составляет около 20-30 аминокислот в длину (рис. 8) [106].
NH,-^^-g|a^3gjj-00000000- соон
Домен холодового С-концевой домен шока (CSD)

Взаимодействие с Взаимодействие с
ДНК РНК
CCL5 IL-
PDGF-B GM-CSF
GM-CSF Со11а
ММР-2 TGF-ß
Со11«1 CD
Со12а
HLA-DR
HLA-DRII

Рис. 8.. Функциональные домены белка YB-1.
CSD содержит алифатические и ароматические аминокислотные
остатки, которые позволяют взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами.