Терапевтический эффект совместной экспрессии генов тимидинкиназы вируса простого герпеса и ГМ-КСФ в опухолях

• Автор: Алексеенко, Ирина Васильевна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 119 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Введение

1.2 Современные подходы к лечению онкологических заболеваний

1.2.1 Молекулярная таргетная терапия рака

1.2.2 Генная терапия рака

1.2.3 Способы повышения эффективности ГНЭПТ систем

1.2.4 Транскрипционный контроль экспрессии терапевтических генов

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Материалы

2.1.1 Культуры клеток и образцы тканей человека

2.1.2 Бактериальные клетки
2.1.3 Реактивы
2.1.4 Ферменты
2.1.5 Антитела
2.1.6 Буферные растворы
2.1.7 Микробиологические среды
2.1.8 Среды для культивирования эукариотических клеток
2.1.9 Наборы реактивов
2.1.10 Маркеры
2.1.11 Оборудование
2.1.12 Олигонуклеотиды
2.2 Методы
2.2.1 Стандартные процедуры
2.2.2 ПЦР
2.2.3 Расщепление плазмидной ДНК эндонуклеазами рестрикции
2.2.4 Лигирование фрагмента ДНК с вектором
2.2.5 Выделение ДНК из агарозного геля
2.2.6 Введение плазмидной ДНК в клетки E.coli
2.2.7 Анализ содержания плазмидной ДНК в клетках колоний E.coli методом ГИДР
2.2.8 Определение нуклеотидной последовательности ДНК
2.2.9 Получение аналитических/препаративных количеств плазмидной ДНК
2.2.10 Выделение и очистка РНК из клеточных линий человека
2.2.11 ОТ-ПЦР
2.2.12 Введение плазмидной ДНК в эукариотические клетки
2.2.13 Приготовление осадков эукариотических клеток
2.2.14 Получение клеточных экстрактов для проведения иммуноблотинга
2.2.15 Анализ содержания белков в клеточных экстрактах методом иммуноблотинга
2.2.16 Получение GM-CSF- кондиционированной среды
2.2.17 Анализ содержания ГМ-КСФ в кондиционированной среде
2.2.18 Функциональный тест на цитотоксичность HSVtk
2.2.19 MTS-тест
2.2.20 Функциональный тест биологической активности hGM-CSF на клеточной линии TF
2.2.21 Определение биологической активности mGM-CSF
2.2.22 Оценка терапевтического эффекта плазмидных конструкций ex vivo на мышах
2.2.23 Доклинические испытания препарата «АнтионкоРАН-М»
2.2.23.1 Оценка терапевтического эффекта препарата «АнтионкоРАН-М» in vivo на мышах
2.2.24 Статистический анализ
2.2.25 Создание плазмидных конструкций, несущих ген люциферазы светлячка под контролем исследуемых промоторов

2.2.26. Создание плазмидных конструкций, несущих гены HSVtk и GM-CSF под контролем промотора CMV
2.2.27 Создание плазмидных конструкций, несущих гены HSVtk и GM-CSF под контролем промоторов PhSurv и PhTSurv
2.2.28 Сайт-направленный мутагенез и создание двойных промоторов, содержащих мутантный промоторгена сурвивина человека
2.2.29 Анализ транскрипционной активности промоторов
2.2.30 Определение точек инициации транскрипции
2.2.31 Интернет ресурсы
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Создание генно-инженерных конструкций, несущих гены HSVtk и GM-CSF под контролем одного промотора
3.2 Анализ экспрессии генов HSVtk и GM-CSF в составе полученных конструкций
3.3 Анализ биологической активности белков HSVtk и GM-CSF, синтезируемых в клетках, трансфицированных полученными конструкциями
3.4 Оценка терапевтического потенциала полученных конструкций ex vivo на животных.
3.5 Оценка терапевтического потенциала полученных конструкций in vivo на животных .
3.6 Доклиническое изучение специфической (противоопухолевой) активности препарата «АнтионкоРАН-М» в составе системы «АнтионкоРАН-М»/ Ганцикловир
3.7 Доклиническое изучение общетоксических свойств препарата «АнтионкоРАН-М»
3.8 Создание искусственных универсальных опухолеспецифических промоторов
3.9 Сравнительный анализ транскрипционной активности двойных тандемных и одиночных промоторов
3.10 В двойных промоторах PhTS и PhST инициация транскрипции происходит только с проксимального промотора
3.11 Промоторная интерференция между проксимальным и дистальным промоторами тандема
3.12 Сравнительный анализ транскрипционной активности тандемных промоторов с укороченной гипотетической neTneftPhTSurv269 и PhTmSurv
3.13 Инициация транскрипции с укороченных тандемных промоторов происходит как с проксимального, так и с дистального промоторов
3.14 Сравнительный анализ транскрипционной активности тандемных промоторов, содержащих полноразмерный промотор гена hSurv с мутантными Spl сайтами
3.15 Анализ активности промоторов PhSurv и PhTSurv269 в системе с использованием терапевтических генов HSVtk и GM-CSF
3.16 Сравнительный анализ активности промоторовРЬБигу, PhTSurv269 и CMV ex vivo на мышах
ГЛАВА 4. ВЫВОДЫ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ACV - acyclovir, ацикловир
araT -l-|i-D-arabinofuranosylthymine, 1 -p-D-арабинофуранозилтимии
BIRC5 - Baculoviral IAP Repeat-Containing protein 5, белок, содержащий повторяющиеся
домены бакуловирусного ингибитора апоптоза
BVDU - (E)-5-(2-Bromovinyl)-2'-deoxyuridine, (Е)-5-(2-бромовинил)-2'-дезоксиуридин
CD - Cytosine Deaminase, цитозиндезаминаза
CD86 - Cluster of Differentiation 86, кластер дифференцировки
CDE — cycle dependent elements
CHR - cell cycle homology region
CMV - CytoMegaloVirus, цитомегаловирус
CNTF - Ciliary neurotrophic factor, цилиарный нейротрофический фактор Сге-белок - Causes REcombination, топоизомераза класса I бактериофага PI Cx - connexin, коннексин Epo - erythropoietin, эритропоэтин
GALV - Gibbon Ape Leukemia Virus, вирус лейкимии гиббона
GAPDH - glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа
GCV - Ganciclovir, ганцикловир, 9- [(1,3-дигидрокси-2-пропокси)метил]гуанин
GM-CSF - Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, гранулоцитарно-
макрофагальный колониестимулирующий фактор
GR-1 - granulocyte differentiation antigen
F4/80 - белок семейства EGF-фактора роста эпидермиса
HSVtk - Herpes Simplex Virus-1 thymidine kinase, тимидинкиназа вируса простого герпеса первого типа
hTERT - human TElomerase Reverse Transcriptase, обратная транскриптаза теломеразы человека
IFN-a2a - interferon, интерферон альфа 2а IFN-a2b - interferon, интерферон альфа 2Ь IL - interleukin, интерликин
1RES - Internal Ribosome Entry Site, участок внутренней посадки рибосомы LD - lethal dose, летальная доза
LIF - Leukemia inhibitory factor Лейкемия-ингибирующий фактор
LoxP - locus of X-over Bacteriophage PI, сайт узнавания Сге-рекомбиназы бактериофага PI LUC - luciferase, люцифераза светлячка

экспрессии

экспрессия
Рис.6. Схема Cre/lox-системы по [212]. Рекомбиназа Сге действует на loxP-сайты, в результате чего происходит удаление стоп-сигнала, расположенного между двумя 1охР-сайтами и эффективная экспрессия гена.
терминатором, расположенным между 1охР сайтами. При одновременном попадании в опухолевую клетку данных векторов синтезированная Сге рекомбиназа вырезает эЮр-сигнал эффекторного вектора, в результате чего запускается экспрессия терапевтического гена.
Данные системы позволяют достигать высокого уровня экспрессии терапевтического гена в клетках опухоли, сравнимого с уровнем экспрессии трансгена под контролем сильного неспецифичного промотора цитомегаловируса. Однако специфичность экспрессии в системе определяется опухолеспецифичным промотором активационного вектора, то есть активация экспрессии терапевтического гена будет происходить только в тех клетках, в которых активен опухолеспецифиченый промотор. Следует заметить, что уровень экспрессии терапевтического гена в данных системах зависит от соотношения эффекторной и активационной конструкций, попавших в клетку.
1.2.4.2.2 Использование химерных и двойных промоторов для экспрессии терапевтических генов
Химерные промоторы могут включать в себя комбинации известных промоторов друг с другом или с отдельными гетерологичными регуляторными элементами с целью увеличить силу и специфичность экспрессии в раковых клетках [220]. Так, активность промотора PSA возрастает в 20 раз при введении дополнительных участков ARE (androgen-responsible element) и дупликации последовательности корового энхансера. [221]. При добавлении Spl мотива к промотору гена HSVtk экспрессия подконтрольного гена люциферазы возрастает в 16 раз [222].
Примером химерного промотора может служить комбинация промотора гена hTERT с минимальным промотором цитомегаловируса (phTERT-CMV) [223]; или с ТАТА боксом, который отсутствует в нативном промоторе гена hTERT [224]. Как правило,