Конструирование вирусоподобных частиц на основе корового белка вируса гепатита B и M2 белка вируса гриппа как основы новых противогриппозных вакцин

• Автор: Блохина, Елена Александровна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 120 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Основы создания противогриппозных вакцин

2. Использование вирусоподобных частиц в качестве высокоиммуногенных носителей вакцинных белков

3. Пептидные аптамеры — новый инструмент молекулярной медицины

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Конструирование вирусоподобных НВс частиц на основе генетически слитых последовательностей М2е и НВс антигена
2. Новый способ презентации чужеродных пептидов на поверхности НВс частиц, основанный на нековалентном связывании пептидов с НВс частицами in vitro
3. Получение вирусоподобных НВс частиц в результате сборки in vitro
ОБСУЖДЕНИЕ
1. Вирусоподобные НВс частицы на основе генетически слитых последовательностей М2е и НВс антигена
2. Метод нековалентного связывания целевых пептидов с вирусоподобными НВс частицами in vitro
ВЫВОДЫ
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЯ, ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ
GFP - зеленый флуоресцентный белок НА - гемагглютинин
НВс - ядерный антиген (коровый белок) вируса гепатита В HBs — поверхностный антиген вируса гепатита В IgG - иммуноглобулин G
М2е - внеклеточный домен М2 белка вируса гриппа
MIR - иммунодоминантная петля (major immunodominant region)
NA - нейраминидаза
a.o. - аминокислотный остаток
ВПЧ - вирусоподобная частица
ЖГВ - живая гриппозная вакцина
ИГВ - инактивированная гриппозная вакцина

ВВЕДЕНИЕ
Вакцинация является одним из наиболее эффективных способов профилактики инфекционных заболеваний человека и животных. «Классические» живые вакцины предполагали использование для иммунизации ослабленной формы возбудителя заболевания. Позднее бьши разработаны способы физической и/или химической инактивации патогенных микроорганизмов, которые позволяли их обезвредить, но сохранить основные иммуногенные свойства. Преимуществами живых и инактивированных вакцин, основанных на «целом» патогене, является высокая иммуногенность, поскольку такие вакцины представляют патоген иммунной системе в его естественной форме. Однако, недостатками таких вакцин является возможность реверсии к высокопатогенной форме или неполной инактивации возбудителя. Кроме того, возможны аллергические реакции и нежелательные побочные эффекты, обусловленные сложным составом препарата, содержащего полный набор белков патогена (а не только основные иммуногенные белки), особенно у людей с ослабленным иммунитетом. Наконец, основанные на целом патогене вакцины содержат генетический материал возбудителя заболевания, что создает возможность рекомбинации при инфекции, которая может привести к образованию новых форм патогена.
Поэтому следующим этапом в разработке вакцин стало создание белковых вакцин, использующих только один или несколько основных высокоиммуногенных белков патогена (антигенов), как правило, поверхностных, или даже их коротких участков (эпитопов), распознающихся антителами. Такие вакцины полностью безопасны, поскольку не содержат ни патогенный организм, ни его генетический материал. Белковые вакцины могут быть получены на основе патогена в результате выделения из него отдельного белка(ов), альтернативой является получение рекомбинантного белка в стандартных организмах-продуцентах с помощью методов генетической инженерии. Однако вследствие значительных отличий в генерации иммунного ответа против целого структурированного патогена и против отдельных белков, подобные вакцины в большинстве случаев вызывают более слабый иммунный ответ, чем основанные на цельных аттенуированных или инактивированных патогенах.
Решением этой проблемы может являться направленное конструирование наноструктур, имитирующих структуру патогена и содержащих отдельные высокоиммуногенные белки патогена на своей поверхности («нановакцины»). Такой подход позволяет использовать преимущества белковых вакцин и нивелировать их недостатки, имитируя структуру патогена и, следовательно, его взаимодействие с иммунной системой. Наиболее эффективным этот подход оказывается при создании

вставкой в позицию 81 последовательности эпитопа (8 а.о.) белка Е2 вируса венесуэльского конского полиомиелита (Loktev et al., 1996).
Была предпринята попытка сконструировать терапевтическую вакцину против аногенитального рака, ассоциированного с вирусом папилломы человека HPV-16. Для этого в область иммунодоминантной петли MIR ввели В-, Т-клеточные эпитопы и эпитопы CTL онкопротеина Е7 папилломавируса человека HPV-16. Полученные химеры успешно вызывали гуморальный и Т-пролиферативный ответы, но не могли инициировать ответ CTL у мышей. (Tindle et al., 1994; Street et al., 1999).
Вставки в иммунодоминантную петлю НВс были достаточно полно изучены при конструировании возможных вакцин против инфекционных заболеваний, причиной которых были внутриклеточные паразиты. Были предприняты попытки разработать вакцины против малярии, для чего в S. typhimurium были получены химерные НВс частицы, несущие чередующиеся эпитопы циркумспорозоитного CS белка Plasmodium falciparum и две последовательности из Plasmodium berghei и Plasmodium yoelli, возбудителей малярии грызунов. Иммунизация мышей очищенными частицами HBc-CS обеспечила не только специфичный В- и Т-клеточный ответы, но и защиту от заражения P. berghei (Schôdel et al., 1994). В целом, экспрессия рекомбинантных генов в S. typhimurium предполагает многообещающую идею оральных вакцин на основе живых авирулентных штаммов Salmonella. Была показана эффективность однократной оральной иммунизации мышей BALB/c рекомбинантным штаммом S. typhimurium, экспрессирующим HBc-CS химеры (Schôdel et al., 1996).
Также в составе MIR был экспрессирован С-концевой сегмент белка SPAG-1, представляющего собой основной поверхностный антиген Theileria annulata, возбудителя коровьего тейлериоза. Химерные частицы индуцировали образование высокого титра нейтрализующих антител, обеспечивали значительный Т-клеточный ответ (Boulter et al., 1995). Проявление некоторого защитного действия гибридных частиц при заражении животных спорозоитом позволяет рекомендовать их для разработки новой вакцины.
Представления рецептор-связывающих последовательностей может быть использовано при изучении взаимодействия рецептор-лиганд. Для этой цели, RGD-содержащий эпитоп белка VP1 вируса ящура FMDV был встроен в MIR молекулы НВс. По-видимому, консервативный триплет RGD играет ключевую роль в связывании VP1 белка вируса ящура с клеточньми рецепторами и, соответственно, в прикреплении вируса к клетке. Аминокислотные замены, а также определенное окружение этого триплета могут ингибировать связывание с инфицированной клеткой. Правильный фолдинг вставок в MIR обеспечивает формирование нативной конформации интересующих нас