Анализ генетических и эпигенетических нарушений хромосомы 3 человека при раке легкого, шейки матки и яичников

• Автор: Дмитриев, Алексей Александрович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 151 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Роль метилирования ДНК в организме человека

1.1.1. Метилирование ДНК и модификации гистонов

1.1.2. Белки группы поликомб (РсО) и их связь с метилированием ДНК при онтогенезе и канцерогенезе

1.1.3. Бивалентные промоторы - элемент гибкости и пластичности генома

1.1.4. Расположение нуклеосом и метилирование ДНК

1.1.5. Возможная роль метилирования внутренних областей гена

1.1.6. Механизмы деметилирования ДНК

1.2. Перспективы использования метилирования в качестве биомаркера
1.2.1. Фоновое метилирование, эффект влияния опухоли на строму
1.2.2. Возможности применения метиломных онкомаркеров для неинвазивных тестов
1.3. Определение паттернов метилирования и выбор генов-кандидатов в биомаркеры с помощью микрочипов
1.3.1. Анализ метилирования с использованием рестриктаз
1.3.2. Анализ метилирования с использованием аффинного обогащения
1.3.3. Анализ метилирования с использованием бисульфитной конверсии
1.3.4. МоЛ-микрочипы — оригинальный метод позволяющий одновременно выявлять метилирование и делении ДНК
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Образцы тканей
2.2. Получение РНК, кДПК и ДНК
2.3. Гибридизация ДНК с использованием ЫоЛ-микрочипов
2.4. Бисульфитное секвенирование
2.5. ПЦР в реальном времени
2.6. Статистический анализ данных
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. ЬИМАИ - приложение для обработки данных ЫоЛ-микрочипов
3.2. Расчет границ относительного сигнала на ЫоП-микрочипе, соответствующих различным вариантам генетических и эпигенетических нарушений
3.3. Анализ генетических и эпигенетических нарушений хромосомы 3 при раке легкого
3.3.1. Анализ метилирования и делеций с помощью ЫоВ-микрочипов и бисульфитного
секвенирования
3.3.2. Оценка изменений уровня мРНК 10-ти генов
3.3.3. Сопоставление данных количественной ПЦР и Ыо^-микрочипов
3.3.4. Статистический анализ данных МоИ-микрочипов в группах опухолей с различными гистологическими и патологическими характеристиками
3.4. Анализ генетических и эпигенетических нарушений хромосомы 3 при раке шейки матки
3.4.1. Анализ метилирования и делеций с помощью МоИ-микрочипов
3.4.2. Подтверждение данных МоЛ-микрочипов методом бисульфитного секвенирования
3.4.3. Оценка изменений уровня мРНК генов ТШЯРЗ (СТИБРЬ) и 1ТОА
3.4.4. Статистический анализ данных МоИ-микрочипов в группах опухолей с различными гистологическими и патологическими характеристиками
3.5. Анализ генетических и эпигенетических нарушений хромосомы 3 при раке яичников
3.5.1. Анализ метилирования и делеций с помощью МоП-микрочипов
3.5.2. Подтверждение данных МоИ-микрочипов методом бисульфитного секвенирования
3.5.3. Статистический анализ данных ЫоИ-микрочипов в группах опухолей с различными гистологическими и патологическими характеристиками
3.6. Сравнительный анализ частот метилирования/делеций при раке легкого, шейки матки и яичников
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АК — аденокарцинома АТФ - аденозинтрифосфат
ВДСРЯ - высокодифференцированный серозный рак яичников
ВПЧ - вирус папилломы человека
ГДФ - гуанозиндифосфат
ГТФ - гуанозинтрифосфат
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ДОЯ - доброкачественная опухоль яичников
кДНК - комплементарная ДНК
М/Д - метилирование/делеции
МРЛ — мелкоклеточный рак легкого
НМРЛ - немелкоклеточный рак легкого
п.н. - пар нуклеотидов
ПЗК - примордиальные зародышевые клетки
ПКР - плоскоклеточный рак
ПКРЛ - плоскоклеточный рак легкого
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РНК - рибонуклеиновая кислота
РШМ - рак шейки матки
ЭСК — эмбриональные стволовые клетки
Зр - короткое плечо хромосомы
3q - длинное плечо хромосомы
cfDNA — свободно циркулирующие молекулы ДНК
CGI - CpG-островок
IncRNA - длинные некодирующие РНК
mel, me2, теЗ - монометилирование, диметилирование, триметилирование SNP - однонуклсотидные полиморфизмы TSG - ген-супрессор опухолевого роста

участка на экспрессию самого гена, либо провести скрининг статуса метилирования данного участка на большом количестве образцов, что также даст возможность оценить и другие свойства маркера, такие как прогностическую ценность и перспективы его применения для дискриминации подтипа опухоли и ДР-
В различных исследованиях часто оценивают уровень метилирования разных участков промотора определённого гена, что нередко приводит к существенным расхождениям в результатах. В частности, речь идёт о двух известных маркерах гепатоцеллюлярной карциномы - полипоз-ассоциированном гене АРС (adenomatous polyposis coli) и гене, кодирующем глютатион-трансферазу, GSTP1 {Jain et al., 2011; Jain et al., 2012).
Также важную роль играет то, на какой нити ДНК, прямой или комплементарной, наблюдается метилирование. Ген АРС в нормальной ткани печени метилирован асимметрично - только по комплементарной нити, в то время как при гепатоцеллюлярной карциноме преобладает метилирование по обеим цепочкам ДНК. Более того, асимметричное метилирование АРС выявлено только для тканей печени, и ни в одном другом из двенадцати органов человека, исследованных в работе {Millar et al., 2000). Также как и разночтения в выборе конкретной области промотора для исследования, зависящий от нити ДНК характер метилирования генов не раз становился причиной возникновения противоречивых результатов {Jain et al., 2013).
Другим источником разночтений в результатах различных исследований
может стать наличие нескольких изоформ мРНК с различными стартами
транскрипции. Для известного гена-супрессора опухолевого роста RASSFI,
белковый продукт которого выполняет целый спектр различных функций, от
ингибирования активности комплекса стимуляции анафазы и ограничения
накопления циклина D1 до участия в трансдукции внешних сигналов апоптоза
(например, Fasl), известно 5 изоформ, транскрибируемых с двух различных
промоторов. Наиболее изучена основная изоформа мРНК - RASSF1A. Для
RASSF1A показана опухолеподавляющая активность, частое снижение