Молекулярное клонирование с помощью двумерного дисплея клеток в слитых гелях

• Автор: Гордеев, Александр Андреевич
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 125 с. : ил.

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Методы скрининга, основанные на 20-формате презентации клеток

1.1.1. Методы на основе выращивания колоний

1.1.2. Методы прямого наблюдения клеток с помощью микроскопа

1.2. Методы скрининга, основанные на 1 Б-формате презентации клеток

1.2.1. Счетчик Коултера

1.2.2. Оптические проточные цитометры

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Работа с клетками прокариот

2.1.1. Штаммы Е. соН

2.1.2. Среды для культивирования Е.соН
2.1.3. Трансформация клеток Е.соН
2.2. Работа с клетками эукариот
2.2.1. Используемые клеточные линии
2.2.2. Питательные среды и культивирования клеток
2.2.3. Пересев клеток
2.2.4. Снятие адгезивных клеток со дна флакона
2.2.5. Подсчет числа клеток в суспензии
2.2.6. Размораживание клеток
2.2.7. Заморозка клеток
2.2.8. Трансфекция клеток
2.2.9. Наблюдение клеток при помощи микроскопа
2.3. Изготовление слитых гелей
2.3.1. Приготовление вытесняющего (первого) полиакриламидного геля
2.3.2. Иммобилизация клеток в слитых гелях
2.4. Манипуляции с клетками в слитых гелях
2.4.1. Промывание гелей на качалке
2.4.2. Выращивание микроколоний
2.4.3. Выделение клеточных клонов
2.5. Методы работы с нуклеиновыми кислотами
2.5.1. Плазмиды
2.5.2. Выделение плазмидной ДНК из клеток E.coli
2.5.3. Выделение хромосомной ДНК из клеток адгезивных клеток эукариот
2.5.4. Фенольная обработка нуклеиновых кислот
2.5.5. Осаждение нуклеиновых кислот этанолом
2.5.6. Электрофорез нуклеиновых кислот
2.5.7. Спектрофотометрическое определение концентрации нуклеиновых
кислот
2.5.8. Расщепление хромосомной ДНК эндонуклеазами рестрикции
2.5.9. Лигазная реакция
2.6. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
2.6.1. ПЦР в жидкости
2.6.2. Секвенирование продуктов ПЦР
2.6.3. ПЦР в геле. Метод молекулярных колоний
2.6.4. Праймеры, используемые в ПЦР
2.6.5. Обнаружение молекулярных колоний ДНК при помощи
гибридизующихся рядом FRET-зондов
3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Цели и экспериментальные задачи
3.2. Двумерный дисплей клеток
3.2.1. Принцип метода слитых гелей
3.2.2. Глубина залегания клеток в геле
3.2.3. Прочность иммобилизации клеток в слитом геле
3.2.4. Плотность монослоя клеток
3.3. Применение двумерного дисплея для скрининга клеток
3.4. Размножение клеток в слитых гелях
3.4.1. Размножение бактериальных клеток
3.4.2. Размножение эукариотических клеток
3.5. Выделение клеточных клонов
3.5.1. Выделение бактериальных клонов
3.5.2. Выделение клонов эукариотических клеток
3.6. Определение числа копий и местоположения вставок гена ОРР в
хромосомах клеток НЕК
3.6.1. Определение числа копий гена СЕР
3.6.2. Определение местоположения вставок гена ОРР
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
4.1. Скрининг клеток
4.2. Культивирование клеток
4.3. Клонирование клеток
4.4. Генетический анализ полученных клонов
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Трансформированные клетки из 5 мл ночной культуры E.coli Z-85 собирали в пробирку эппендорф на 1,7 мл последовательным центрифугированием в течение 30 секунд при 12000xg, а затем проводили грубое выделение методом щелочного лизиса. Клеточный осадок суспендировали в 200 мкл свежеприготовленного раствора I (25 мМ трис-НС1, pH 8,0, 10 мМ ЭДТА, 50 мМ глюкоза, 2мг/мл лизоцим) и инкубировали в течение 15 минут при 37°С. Затем к 200 мкл суспензии добавляли 400 мкл свежеприготовленного раствора II (200 мМ NaOH, 1% ДСН), интенсивно перемешивали и инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре, после чего добавляли 300 мкл 3 М ацетата Na, pH 4,8. Образцы перемешивали и осветляли центрифугированием в течение 10 минут при 12000*g. Супернатант отбирали и добавляли к нему 540 мкл изопропанола, после чего инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре. Осадок собирали центрифугированием в течение 10 минут при 12000xg, промывали его равным объемом 80% этанола и растворяли в 180 мкл 200 мМ трис-НС1, pH 9,0. К раствору добавляли 20 мкл 1 М MgCl2 и инкубировали в течение 30 секунд в кипящей водяной бане, затем быстро охлаждали на льду и осветляли 10-минутным центрифугированием при 12000xg. Для полной деградации РНК надосадочную жидкость инкубировали в кипящей водяной бане еще 30 минут. Затем образцы подвергали фенольной депротеинизации, после чего ДНК осаждали в присутствии 300 мМ NaCl и 75% этанола в течение 1,5 - 2 часов при -20°С. Осадок собирали центрифугированием в течение 15 минут при 12000xg. Для освобождения от нуклеотидов и олигонуклеотидов осадок промывали в 300 мкл раствора PSE при интенсивном встряхивании на шейкере (Eppendorf) в течение 1 часа. Раствор PSE готовили, добавляя к раствору 300 мМ NaCl и 200 мМ цитрата Na этанол до 45% по объему. После промывания в растворе PSE осадок собирали центрифугированием в течение 15 минут при 12000xg и дважды промывали в 300 мкл 80% этанола. Осадок подсушивали и растворяли в буфере ТЕ (10 мМ трис-НС1,