Активность факторов терминации трансляции из организмов с вариантными генетическими кодами

• Автор: Елисеев, Борис Дмитриевич
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 129 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Терминация трансляции у бактерий
2. Терминация трансляции у эукариот
2.1. Общая модель терминации трансляции в
эукариотических клетках
2.2. Фактор терминации трансляции первого класса эукариот (еШП)
2.2.1. еКТТ: общие сведения
2.2.2. Структурная организация еКП и её связь с функцией белка
2.2.3. Поиск участков белка eR.Fl, вовлеченных в узнавание стоп кодонов
2.3. Фактор терминации второго класса эукариот (еКРЗ)
3. Терминация трансляции у архей
4. Вариантные генетические коды
4.1. Организмы с вариантным генетическим кодом
4.2. Эволюция генетического кода
4.3. Ресничные - группа эукариот с максимальным разнообразием генетических кодов
4.4. Факторы терминации трансляции еШП ресничных инфузорий
4.5. Археи с вариантным генетическим кодом
5. Заключение
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Материалы
1.1. Реактивы

1.2. Ферменты
1.3. Штаммы и плазмиды
1.4. Олигонуклеотиды
1.5. Среды
2. Методы исследования
2.1. Получение плазмид, содержащих гены aRFl
2.2. Получение плазмид для экспрессии химерных белков а/eRFl и химерного белка eRFl Blepharisma/человек
2.3. Получение генетических конструкций для экспрессии химерных белков eRFl Euploteslчеловек
2.4. Получение конструкций для экспрессии eRFl Blepharisma japonicum и химерного белка eRFl
Blepharisma/чеповек in vivo
2.5. Полимеразная цепная реакция
2.6. Электрофорез ДНК в агарозном геле
2.7. Очистка фрагментов ДНК в легкоплавкой агарозе
2.8. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции
2.9. Лигирование ДНК
2.10. Трансформация E. coli плазмидной ДНК
2.11. Анализ клонов методом ПЦР
2.12. Выделение плазмидной ДНК из E.coli
2.13. Определение первичной структуры (секвенирование) ДНК
2.14. Экспрессия и выделение белков
2.15. Электрофорез белков в денатурирующем 12% ПААТ
2.16. Определение активности eRFl in vitro (тест Каски)
2.17. Получение мРНК
2.18. Выделение рибосом
2.19. Выделение факторов трансляции (нативных и рекомбинантных)
2.20. Аминоацилирование тРНК
2.21. Сборка претерминационного комплекса
2.22. Проверка качества претерминационных комплексов
2.23. Определение эффективности терминации трансляции
2.24. Культура клеток и трансфекция
2.25. Измерение активности люциферазы и р-галактозидазы
2.26. Определение уровня “сквозного прочтения” (read-through)
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Терминация трансляции архей
1.1. Факторы терминации трансляции архей aRFl активны в реконструированной in vitro эукариотической системе трансляции
1.2. Декодирование UAG в пирролизин-содержащих археях
1.2.1. Биоинформатический анализ геномов-архей порядка
Methanosarcinales
1.2.2 Факторы терминации трансляции a/eRF 1 пирролизин-содержащих архей рода Methanosarcina узнают все три стоп кодона
2. Терминация трансляции у ресничных инфузорий с вариантным генетическим кодом
2.1. UAR-специфичность фактора- терминации трансляции eRPl Euplotes aediculatus определяется аминокислотными остатками области
2.1.1. Выбор метода определения- активности химерных белков
2.1.2. Определение участка аминокислотной последовательности eRFl Euplotes, ответственного за запрет узнавания кодона UGA

стоп кодонов остается только два, что подтверждено опытами in vitro (Oba et al., 1991). Последовательность событий, которые привели к превращению UGA в триптофановый кодон, приведены на Рис.12. Предполагается, что под действием сильного АТ -давления, у предка Mycoplasma capricolum (Рис. 12, b) стоп кодон UGA был полностью заменен на UAA, и RF2, узнававший стоп кодон UGA, исчез.
(a) UGG
(b) UGG
(c) UGG
(d) UGA
Рис. 12. Эволюция. UGÄ кодона у Mycoplasma capricolum. Буквами (а) и (d) отмечены стадии, которые наблюдаются соответственно у Acholeplasma laidlawi и Mycoplasma capricolum. (b) и (с) - промежуточные стадии. UCA антикодоном на рисунке обозначен *UCA (Ohama et а]., 2008) '
В результате у предка Mycoplasma UGA стал незначащим кодоном, а UGG все еще оставался единственным триптофановым кодоном, так как тРНК с антикодоном ССА не комплементарен кодону UGA. Для того чтобы возникла новая тРНК с ТСА антикодоном, необходима была дупликация гена тРНК с антикодоном ССА, с последующей мутацией в антикодоне (Рис. 12). Это - подтверждается наличием в геноме Mycoplasma capricolum двух генов триптофановой тРНК, расположенных тандемно, с антикодонами ТСА и ССА (Yamao et alt, 1988). Также обнаружены транскрипты этих генов (тРНК с антикодонами *UCA и ССА) (Andachi et al., 1989).
Потеря RF2 могла произойти между стадиями (а) и (Ь) (Рис. 12). Если бы RF-2 остался функционально активным, то находящиеся в рамке считывания UGA распознавались бы одновременно и тРНК *UCA и RF2, что приводило бы к синтезу как полного, так и укороченного полипептидов, а это

Trp codons
codon
UGG — UGG — UGG
tRNA
(anticodon) S
CCA RF1 RF2
.— UGG — UGG
I H-i

UGA — UGG

CCA CCA RF1
UCA CCA
UCA CCA RHi