Анализ транскриптома Mycobacterium avium методом широкомасштабного секвенирования

• Автор: Игнатов, Дмитрий Васильевич
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 95 с. : ил.

Оглавление
Список сокращений
Обзор литературы. Использование широкомасштабного секвенирования для изучения бактериального транскриптома
Введение
Методология Ю^А-эея
Технологические платформы ССП
Подготовка РНК к секвенированию
Модификации 1ША-зея
Синтез и амплификация кДНК
Обработка данных КЫА-Бед
Примеры использования Ю4А-Бец
Экспрессия мРНК
Некодирующий транскриптом
Исследование некодирующего транскриптома микобактерий
Заключение
Материалы и методы
Материалы и лабораторное оборудование
Оборудование
Расходные материалы
Коммерческие наборы и ферменты
Химические реактивы
Буферные и другие растворы
Олигонуклеотиды
Методы и протоколы

Электрофоретическое разделение фрагментов нуклеиновых кислот в агарозном геле
Трансформация компетентных клеток вектором, несущим вставку, и высев клеток на селективную среду
Выделение плазмид
Определение нуклеотидной последовательности вставок рекомбинантных клонов библиотек
Выращивание М. avium и заражение мышей
Выделение РНК из М. avium
Выделение геномной ДНК из М. avium
Разделение фрагментов РНК в денатурирующем полиакриламидном геле
Синтез кДНК из коротких фрагментов РНК
5’ SMART-RACE, 3’ RACE и проверка на котранскрипцию для межгенных малых РНК
Подготовка РНК к секвенированию на Illumina
Обработка данных секвенирования РНК
Нозерн-блоттинг
RLM-RACE
Количественная ПЦР в реальном времени
Программное обеспечение
Результаты и обсуждение
Введение
Малые РНК М. avium, выявленные клонированием коротких фрагментов и поиском гомологов у М. tuberculosis
Транскриптом М. avium при росте в культуре, определённый методом RNA-seq
Транскрипция с межгенных участков превышает транскрипцию белок-кодирующих генов в средне-логарифмической фазе роста
Геном М. avium hominissuis 104 содержит 25 полиморфизмов протяженных последовательностей (LSP), отсутствующих у М. avium ТМС
76% генов М. avium транскрибируется на значимом уровне
Треть из выявленных ТНТ соответствуют безлидерным транскриптам
Рибопереключатели М. avium
Некодирующие РНК М. avium, выявленные с помощью RNA-seq
Межгенные малые РНК М. avium и М. tuberculosis
Экспрессия igMAV_0468-0469 и igMAV_0469-0470 при развитии инфекции
Выводы
Список литературы
Приложение 1: Скрипты
Приложение 2: Антисмысловые РНК
какие-то выводы об изменении физиологии микроорганизма. Простой, но чрезвычайно широко используемый подход для осуществления этого состоит в том, чтобы разбить гены на функциональные категории и выявить повышенно и пониженно экспрессирующиеся функциональные категории. Этот подход носит название «анализ повышенной представленности» (functional over-representation analysis). Он широко применялся ещё в исследованиях с использованием микрочипов и имплементирован во множестве программ, например DAVID [94] или GSEA [95]. Разные программы используют различные алгоритмы, хотя в их основу положен единый принцип. Если функциональная категория не обогащена среди группы генов с повышенной или пониженной экспрессией, то относительное содержание генов этой функциональной категории будет одинаковым в этой группе или в геноме. И наоборот, если функциональная категория обогащена среди высоко или низко экспрессирующихся генов, то относительное содержание генов этой функциональной категории будет выше, чем в среднем по геному. Самый простой критерий для проверки этого - тест Фишера. В простейшей форме такой принцип имплементирован в DAVID [94]. В GSEA реализован более сложный алгоритм, но его описание выходит за рамки обзора. К тому же, в силу некоторых особенностей, его нельзя применять к данным RNA-seq. В любом случае, этот подход не лишён искажений. Действительно, на длинные гены в среднем картируется больше прочтений, чем на короткие. Это приводит к тому, что в среднем для длинного гена проще обнаружить дифференциальную экспрессию, чем для короткого. Достаточно часто какая-либо функциональная категория оказывается обогащена длинными или короткими генами, и для неё соответственно проще и сложнее обнаружить изменение экспрессии. Это искажение учтено в программе GOSeq [90]. До настоящего момента она не использовалась в бактериальной транскриптомике, а анализ повышенной представленности проводился тестом Фишера [91]. Как и для поиска дифференциально экспрессирующихся генов, при анализе повышенной представленности необходима коррекция на множественное сравнение. Для этого используется поправка Бонферрони [71] или FDR [91].
Откуда берутся функциональные категории? Большая часть белков какого-либо микроорганизма имеют ортологи у других микроорганизмов, как родственных, так и эволюционно-отдалённых. Ортологами называют белки, которые являются прямыми