Исследование сигнальной функции пероксида водорода с помощью генетически кодируемых флуоресцентных индикаторов

• Автор: Мишина, Наталия Михайловна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 110 с. : ил.

Оглавление

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I: ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. АКТИВНЫЕ ФОРМЫ КИСЛОРОДА, КАК УЧАСТНИКИ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ СИГНАЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ

1.1. История

1.2. Источники АФК в клетке

1.3. Сигнальные функции АФК

1.4. Пероксид водорода как сигнальная молекула

Продукция пероксида водорода

Механизм передачи сигнала с помощью Н202

Модификация тиоловых остатков
Деградация Н202
II. ИАБРН-ОКСИДАЗЫ: ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
И. 1. История открытия ИАБРН-оксидаз
П.2. Строение и активация ИАОРН-оксидазы на примере ИАБРН-
оксидазы фагоцитов (Иох2)
Строение N0x2
Активация N0x2

И.З. Представители семейства Иох, доменная структура и общие принципы активации

11.4. Физиологическая роль Nox-белков
11.5. Nox-белки и заболевания
III. КОМПАРТМЕНТАЛИЗАЦИЯ СИГНАЛИЗАЦИИ С УЧАСТИЕМ АФК
III. 1. Компартментализация за счет кинетических и диффузионных ограничений
III. 2. Компартментализация за счет специфической локализации источника: локализация NADPH-оксидаз
Локализация NADPH-оксидаз, участвующих в процессе
направленного движения клетки
Кавеолы/липидные рафты
Эндосомы
Эндоплазматический ретикулум
Ядро
IV. МЕТОДЫ ДЕТЕКЦИИ Н202 В КЛЕТКАХ
IV. 1. Детекция внутриклеточного H202 с помощью 5-(и 6-) -хлорметил- 2',7'-дихлордигидрофлуоресцииндиацетата (CM-DCFH-DA)
IV.2. Визуализация внутриклеточного Н202 с помощью Peroxy Green 1 и
Peroxy Crimson
IV.3. Визуализация внутриклеточного Н202 с помощью SNAP-tag
IV.4. Визуализация H202 с помощью генетически кодируемых редокс-чувствительных флуоресцентных белков
roGFP и roGFP2

roGFP-Orpl
HyPer
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ
ГЛАВА II: МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
II. 1 МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ
II. 1.1. Оборудование
II. 1.2. Материалы
Реактивы
Ферменты для молекулярного клонирования и метериалы для ПЦР 57 Векторы
Буферные растворы
Бактериальные штаммы и среды
Ростовые факторы и микросферы
Ингибиторы PI3-киназы и NADPH-оксидазы
Клеточные линии и среды
Материалы для конфокальной и флуоресцентной микроскопии
II.2. МЕТОДЫ
II.2.1. Молекулярное клонирование
Амплификация ДНК
Электрофорез в агарозном геле

«шлюза» находится предположение, что низкие концентрации Н202 эффективно нейтрализуются пероксиредоксинами, а высокие концентрации Н202 приводят к локальной инактивации пероксиредоксинов, что способствует далее окислению сигнальных белков-мишеней.
Согласно этой гипотезе диффузионное расстояние, т.е. расстояние, которое окислитель преодолевает до взаимодействия с мишенью, должно быть достаточно небольшим по сравнению с диаметром клетки (в среднем 10-20 мкм). Как показано на Рис 7. глутатион (СБН) в концентрации, соответствующей внутриклеточной, не способен ограничить диффузию Н202 в пределах диаметра клетки. Присутствие же большого количества высоко реакционноспособных пероксиредоксинов является достаточным условием для ограничения диффузии Н202 пределах нескольких микрон (Рис. 7). Поэтому для эффективного окисления белка-мишени необходимо его прямое взаимодействие с комплексом, продуцирующим Н202.
Рис. 7. Схема диффузионных расстояний некоторых окислителей.
Диффузионные расстояния приведены для окислителей в присутствии физиологической концентрации глутатиона (СБН) 2 мМ (розовый круг) по отношению к среднему значению диаметра клетки (20 рм, голубой). Показано диффузионное расстояние Н202 (желтый круг) в присутствии пероксиредоксина 2 (Ргх2) в расчетной физиологической концентрации 20 рМ. Клетка справа уменьшена в 10 раз по сравнению с левым изображением для демонстрации, что диффузионные расстояния для Н202 могут быть значительно больше чем диаметр клетки. (С изменениями по [1 6)
Одним из способов повысить шансы прохождения реакции между Н202 и его мишенью является ограничение белка-мишени и источника Н202 (ЛАОРН-оксидазы) в пределах одного клеточного компартмента. Таким образом, в зависимости от места продукции АФК дальнейшие их действия могут приводить к разным внутриклеточным последствиям.