Функциональная характеристика транскриптомов опухолевых и нормальных тканей мочевого пузыря человека

• Автор: Заболотнева, Анастасия Александровна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 129 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРА ТУРЫ

ГЛАВА I. РАК МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ: ПРОБЛЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ДИАГНОСТИКИ

1 1 Причины возникновения рака мочевого пузыря и проблемы его диагностики

1 2 Применяемые в клинике методы диагностики и маркеры РМП

1 3 Методы поиска биомаркеров

ГЛАВА II. ОБЗОР ШИРОКОМАСШТАБНЫХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ КАНЦЕРОГЕНЕЗА

2.1. Методы, изучающие генетические изменения, происходящие во время онкогенеза

211 Исследование экспрессии генов с помощью анализа на микрочипах

2 12 Высокопроизводительное секвенирование геномов раковых клеток
2 13 Секвенирование экзомов опухолевых клеток
2 14 Широкомасштабный скрининг геномов с помощью библиотек коротких интерферирующих РНК и кДНК
2 15 Анапа альтернативных промоторов и альтернативного сплайсинга с целью поиска неканонических генов, вовлеченных в канцерогенез
2.2. Методы, изучающие эпигенетические изменения при канцерогенезе
2 2 1 Изучение структуры хроматина
2 2 2 Изучение метилирования ДНК
2.3. Методы, изучающие протеомные изменения при канцерогенезе
ГЛАВА III. БИОИНФОРМАТИЧЕСКИЙАНАЛИЗ ПОЛУЧАЕМОЙ ИНФОРМАЦИИ
ГЛАВА IV. ИНТЕГРАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ГЕНОМИКЕ
МА ТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Биологические образцы
2. Реактивы, расходные материалы и приборы, использованные в работе
3. Выделение тотальной РНК из образцов тканей
4. Выделение геномной ДНК из образцов тканей мочевого пузыря
5. Полимеразная ценная реакция (ПЦР)
6. ОТ-ПЦР
7. Количественная ПЦР
8. Электрофорез в агарозном геле
9. Очистка продуктов ПЦР из агарозного геля
10. Супрессионная вычитающая гибридизация кДНК

11. Секвенирование и анализ библиотек кДНК
12. Исследование экспрессии генов с помощью микрочипов
13. Создание и анализ библиотек коротких РНК
13 1 Получение библиотек коротких РНК
13 2 Биоинформатический анализ библиотек коротких РНК
14. Исследование метилирования ДНК с помощью микрочипов
15. Статистический анализ корреляции степени дифференцировки, инвазии, метастазирования и размера опухолей и экспрессии генов-маркеров РМП
16. Анализ базы данных MedLINE
17. Анализ базы данных GEO
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Биоинформатический анализ экспрессии генов-маркеров
2. Характеристика профилей транскрипции генов в опухолевых и нормальных клетках мочевого пузыря с помощью супрессионной вычитающей гибридизации кДНК и гибридизации на микрочипах
2 1 Анализ экспрессии генов методом СВГ
2 2 Анализ экспрессии генов методом гибридизации на микрочипах
2 3 Обнаружение новых экспрессионных маркеров РМП
3. Исследование профилей экспрессии микроРНК в раковых и нормальных клетках мочевого пузыря
3 1 Исследовании экспрессии генов-маркеров, кодирующих микроРНК
3 2 Исследование экспрессии коротких некодирующих РНК (кнРНК) с помощью глубокого секвенирования библиотек кнРНК
4. Оценка диагностической ценности микроРНК маркеров экспериментальными методами
4 1 Анализ экспрессии генов, кодирующих микроРНК
4 2 Высокопроизводительное секвенирование микроРНК
4 3 Обнаружение новых маркерных микроРНК в РМП
5. Исследование профилей метилирования ДНК в раковых и нормальных клетках мочевого пузыря
3 1 Проверка диагностической ценности маркеров метилирования ДНК в РМП
5 2 Обнаружение новых маркеров метилирования ДНК в РМП
6. Анализ корреляции экспрессии и метилирования генов-маркеров со степенью прогрессии РМП
6 1 Маркеры генной экспрессии
6 2 Маркеры метилирования ДНК
7. Интегрированная база данных опубликованных маркеров РМП
8. Исследование экспрессии ретроэлементов генома SVA и SVAfj в раковых и нормальных клетках мочевого пузыря
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬ ТА ТОВ

1. Крупномасштабные методы исследования транскриптомов и геномов позволяют оценить диагностическую ценность известных макеров РМП
2. Крупномасштабные методы исследования транскриптомов и геномов позволяют обнаружить новые дифференциальные транскрипты, короткие РНК или эпигенетические изменения, специфичные для РМП
3. Крупномасштабный анализ транскриптомов и геномов опухолевых и нормальных клеток позволяет выявить основные пути канцерогенеза и разработать подходы к индивидуализированной терапии опухолей
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРА ТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ

В дополнение к исследованию трехмерной структуры хроматина в опухолевых клетках может быть использован метод CAGE (от англ. Cap Analysis of Gene Expression) для определения всех точек начала транскрипции, образованных за счет связывания с ними факторов инициации транскрипции. CAGE является высокопроизводительным методом анализа нуклеотидной последовательности на 5’-конце копированных молекул РНК (126-128). Копированные молекулы РНК отбираются из суммарной РНК путем аффинного связывания и используются для синтеза кДНК. К полученным кДНК лигируется специальная последовательность ДНК, которая позволяет образовывать конкатамеры, содержащие первые 20 нуклеотидов с 5’ -конца соответствующих РНК. Затем полученные конкатамеры секвенируют и определяют, таким образом, в одном эксперименте тысячи точек начала транскрипции. Преимуществом данного метода является возможность определить изменения в транскрипции участков генома, соответствующих не только генам, но и регуляторным локусам, кодирующих миРНК, антисмысловые РНК, длинные некодирующие РНК и другие регуляторные молекулы, которые могут быть специфичными для раковых клеток. Путем интегрирования данных о структуре хроматина и транскрипционном профиле клетки можно понять логику регуляции транскрипции и расширить наше представление о молекулярных изменениях, возникающих при канцерогенезе (129).
2.2.2. Изучение метилирования ДНК.
Метилирование ДНК является важнейшим способом эпигенетической регуляции экспрессии генов в эукариотических клетках (130). Метилирование динуклеотидов CpG внутри регуляторных последовательностей генома часто приводит к снижению или подавлению экспрессии генов (131, 132). Глобальное гиперметилирование промоторов некоторых генов, подавляющих развитие опухолей, является важным условием злокачественной трансформации клеток (133, 6).
Для анализа метилирования ДНК были разработаны многочисленные методы, подробно описанные в ряде работ (134-137). Все эти подходы основаны на трех методах: бисульфитной конверсии ДНК, расщеплении метил-чувствительными эндонуклеазами рестрикции и аффинной очистке метилированной ДНК. Схемы этих методов и их краткое описание представлены на рисунках 7-9.