Изучение надмолекулярной организации и нанотехнологическое применение жгутиков Halobacterium salinarum при помощи методов модификации генов флагеллинов

• Автор: Безносов, Сергей Николаевич
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 119 с. : ил.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Аппарат подвижности архей

1.1. Морфология и принцип функционирования жгутика архей

1.2. Субъединичный состав жгутиков

1.3. Ультраструктура нити жгутиков

1.4. Гены флагеллинов архей

1.4.1. Генная инженерия архей

1.4.2. Семейства жгутик-ассоциированных генов архей

1.5. Сборка жгутика архей

Глава 2. Использование биополимеров для создания наноматериалов

ЧАСТЬ II. МЕТОДИЧЕСКАЯ

Глава 3. Материалы и методы исследования
3.1. Химические реагенты и ферменты
3.2. Буферы и другие растворы, использованные в работе
3.3. Среды
3.4. Штаммы микроорганизмов
3.5. Плазмиды
3.6. Методы
3.6.1. Выделение плазмидной ДНК
3.6.2. Выделение хромосомной ДНК Н. заИпагит
3.6.3. Полимеразная цепная реакция
3.6.4. Рестрикция ДНК
3.6.5. Электрофорез в геле агарозы
3.6.6. Очистка фрагментов ДНК
3.6.7. Дефосфорилирование и кинирование 5' -концов ДНК
3.6.8. Лигирование ДНК
3.6.9. Получение компетентных клеток Е.соИ
3.6.10. Трансформация компетентных клеток Е.соИ плазмидной ДНК
3.6.11. Трансформация клеток Н. заИпагит
3.6.12. Гибридизация по Саузерну
3.6.13. Выделение жгутиков
3.6.14. Электрофорез белков в ДСН-ПААГ
3.6.15. Иммуноблоттинг
3.6.16. Электронная микроскопия
3.6.17. Иммуно-электронная микроскопия
3.6.18. Эксперименты по связыванию ионов металлов и частиц коллоидного золота
3.6.19. Фрагментация жгутиков ультразвуком
3.6.20. Электрохимическое тестирование минерализованных жгутиков в качестве электродов
ЧАСТЬ III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ..
Глава 4. Получение и анализ штаммов Н. заИпагит с делегированными флагеллиновыми генами
4.1. Плазмидные конструкции, использованные для получения штаммов Н. заИпагит с делегированными флагеллиновыми генами
4.1.1. Плазмидные конструкции для делеции А- и В-флагеллиновых оперонов
4.1.2. Плазмидные конструкции для делеции по отдельности А1, и А2-флагеллиновых генов
4.1.3. Плазмидные конструкции для внесения отдельных В-флагеллиновых генов и их тандемов в бесфлагеллиновый штамм Af!gAAflgB Н. заИпагит
4.2. Получение штаммов НлаИпагит с делетированными флагеллиновыми генами
4.2.1. Получение штаммов AflgA, AflgB, AflgAAflgB, AflgAlAflgB и А^А2А^В Н. заИпагит
4.2.2. Получение штаммов AflgAAflgBlAflgB2, AflgAAflgB2AflgBЗ, AflgAAflgBЗ и AflgAAflgB2 Н. заИпагит
4.3. Анализ штаммов Н.яаИпагит с делетированными флагеллиновыми генами
Глава 5. Метод направленной модификации флагеллинов
5.1. Получение генетических конструкций и выбор места модификации
5.1.1. Получение плазмидной конструкции рЬГХА
5.1.2. Мутагенез плазмиды рЫХА
5.1.3. Получение плазмидной конструкции р№ПЪАОА1
5.1.4. Получение плазмидной конструкции рКХЕЬАОА2
5.1.5. Получение плазмидной конструкции рКХОоША2
5.1.6. Получение плазмидной конструкции рИХВ
5.1.7. Получение плазмидной конструкции рМХРЬАОВ2
5.2. Получение и анализ штаммов с модификациями флагеллинов
5.3. Использование жгутиков архей для создания новых наноматериалов
5.3.1. Получение наноматериала на основе РЬАОА1-модифицированных жгутиков Н. яаИпагит
5.3.2. Получение наноматериала на основе модифицированных жгутиков
Н. заИпагит и использование его для создания электрода для литий-ионного аккумулятора
5.3.3. Получение наноматериала на основе фрагментированных модифицированных жгутиков Н. sa.lina.rum и использование его для создания электрода для литий-ионного аккумулятора
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

сушильном шкафу, прессование, окончательную сушку в вакууме форвакуумного насоса. Для приготовления активной массы механическую смесь активного вещества (75 мае. %) и ацетиленовой сажи (15 мае. %) тщательно перетирали в агатовой ступке. Затем в эту смесь добавляли связующее (поливинилиденфторид, 10 мас.%), предварительно растворенный в А-метилпирролидоне. Полученную жидкую смесь обрабатывали на ультразвуковом диспергаторе в течение 30 с. Токопроводящую основу (подложку) для электродов вырезали из никелевой сетки толщиной 50 мкм. Токоподвод из никелевой фольги такой же толщины приваривали к подложке контактной сваркой. На одну сторону подложки с помощью скальпеля наносили активную массу. Далее электроды сушили в сушильном шкафу при температуре 80 °С до постоянного веса. После сушки электроды прессовали усилием 1000 кг/см2 в течение 15 с. Окончательную сушку электродов проводили в вакууме форвакуумного насоса при температуре 120 °С в течение 8 часов. Масса активного вещества на электродах составляла 7 - 10 мг/см2. Сборку ячеек проводили в боксе с атмосферой сухого аргона. Герметичные ячейки содержали рабочий (исследуемы) электрод, вспомогательный электрод и электрод сравнения. Вспомогательный и электрод сравнения готовили путем накатки лития на подложку из литиевой фольги. Электроды разделяли сепаратором из полипропилена толщиной 25 мкм. В качестве электролита использовали обычные для литиевых источников тока растворы: 1 М 1ЛС104 в смеси пропиленкарбонат-диметоксиэтан (7:3) (далее электролит № 1) или 1 М ЬіРР6 в смеси этиленкарбонат-диэтилкарбонат-диметилкарбонат (1:1:1) (далее электролит № 2). Содержание воды в электролитах не превышало 50 ррш. Гальваностатическое циклирование исследуемых электродов проводили током 20 мА/г активного вещества (Со304). Пределы циклирования составляли 3.0 - 0.01 В.