Исследование функциональной активности химически модифицированной рекомбинантной бутирилхолинэстеразы человека in vitro и in vivo

• Автор: Илюшин, Денис Григорьевич
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 107 с. : ил.

Оглавление
Введение
Список сокращений
Обзор литературы
Терапия и профилактика отравлений ФОТ
Биологический антидоты как средство профилактики и терапии ]
отравлений ФОТ
Бутирилхолинэстераза человека
Биотехнологическое получение рекомбинантной бутирилхолинэстеразы
человека
Материалы и методы
Реактивы и материалы
Бактериальные штаммы
Клеточные линии
Растворы и бактериальные среды
Антибиотики
Методы работы с нуклеиновыми кислотами
Методы работы с бактериями Escherichia coli
Методы работы с эукариотическими клетками линии СНО
Методы работы с белками
Методы работы с животными
Результаты и обсуждение
Создание эукариотической системы экспрессии человеческой
бутирилхолинэстразы
Разработка системы детекции и оценки продукции рекомбинантного белка
Характеристики рекомбинантной БуХЭ
Оптимизация фармакокинетических параметров рчБуХЭ химическим
полисиалированием in vitro
Исследование защитной эффективности модифицированной рчБуХЭ in vivo 87 Выводы
Список литературы
Приложения

Введение
Цель работы состояла в создании эффективной системы экспрессии рекомбинантной бутирилхолинэстеразы (БуХЭ) человека и исследовании функциональной активности полученного фермента в экспериментах in vitro и in vivo. Для ее достижения были поставлены следующие экспериментальные задачи:
1. создание эффективной эукариотической системы экспрессии функционально активной БуХЭ человека;
2. изучение физико-химических свойств рекомбинантной БуХЭ человека;
3. оптимизация фармакокинетических характеристик рекомбинантного фермента;
4. определение эффективности полученного препарата рекомбинантной БуХЭ для профилактики отравлений ФОТ.
Клетки линии СНО были выбраны в качестве наиболее сбалансированным решения проблемы экспрессии рекомбинантной БуХЭ. Ген БуХЭ был клонирован под контроль промотора фактора элонгации полипептидной цепи (EF-al). После проведения стабильной трансфекции и оптимизации условий продукции на специализированных безбелковых ростовых средах удалось получить клон АЗ продуцирующий до 30 мг рекомбинантной бутирилхолинэстеразы человека (рчБуХЭ) на литр ростовой среды, что как минимум на порядок выше, чем в ранее разработанных системах. Для изменение олигомерного состава рекомбинантного фермента клон АЗ был трансфицирован фрагментом ДНК, несущим ген обогащенного остатками пролина пептида PRAD под контролем промотора EF-al. В результате отбора был получен стабильный клеточный клон АЗН9, продуцирующий БуХЭ в основном форме димера и тетрамера. Опыты на мышах линии BALB/c рчБуХЭ показали, что фармакокинетические параметры смеси олигомеров рчБуХЭ не позволяет эффективно использовать рекомбинантный фермент для профилактики отравлений ФОТ.
Для радикального увеличения времени полувыведение препарата рчБуХЭ из крови была предложена химическая модификация гомополимеры N-ацетилнейраминовой кислоты - сиалирование. В отличие по полимеров
этиленгликоля, широко применяемых для модификаций рекомбинантных белков, гетеро- и гомополимеры сиаловой кислоты являются биодеградируемыми молекулами, не являются токсичными и не накапливаются в тканях и внутренних органах. Таким образом, модификация полисиаловыми кислотами позволяет снизить риск возможных побочных действий рчБуХЭ, тем самым лучше вписываясь в концепцию биологического антидота. Применение комбинаторного подхода позволило определить оптимальные условия реакции химического полисилирования рчБуХЭ, при которых удалось добиться не менее 80% выхода реакции при относительно не высокой (не более 10%) потере удельной активности рекомбинантного фермента.
Полученные конъюгат рчБуХЭ с гомополимерами сиаловой кислоты (рчБуХЭ-СА027) был подвергнут всестороннему анализу in vitro и in vivo. Установлено, что химическая модификация полисиалированием не влияет на олигомеризацию рчБуХЭ. Масс-пекрометрическое исследование конъюгата рчБуХЭ-СА027 позволило выявить по меньшей мере 6 потенциальных сайтов модификации рекомбинантного фермента. Сравнение кинетических констант гидролиза (Хм, fcat, Kss и b) бутирилтиохолин иодида модифицированной и не модифицированной рекомбинантной рчБуХЭ и БуХЭ из плазмы крови человека показало, что полученные значения отличались от известных из литературы в пределах ошибки, что свидетельствует об интактности активного центра фермента и его окружения. Фармакокинетические испытания in vivo на мышах линии BALB/c свидетельствуют о том, что в результате химического полисиалирования время полувыведения конъюгата рчБуХЭ-СА027 возросло в 6 раз по сравнению с немодифицированной рчБуХЭ и стало сопоставимо со временем полувыведения препарата нативной БуХЭ плазмы крови человека. Таким образом впервые химическое полисиалирование было успешно применено для модификации сложного глобулярного фермента.
Способность рчБуХЭ и рчБуХЭ-СА027 эффективно связывать агент VR in vitro стало основанием для проведения эксперимента на животных. В результате испытания in vivo на беспородных мышах доказано, что препарат рекомбинантной БуХЭ плазмы крови человека, модифицированный полимерами N-ацетилнейраминой кислоты при внутривенном введении в дозировке 21 мг/кг живого веса обеспечивает профилактическую защиту от действия 4.2 ЛДзо агента
Табл. 3. Сводная таблица данных по фармакокинетическим испытаниям БуХЭ.
Фермент Происхождение Олигомеризация Объект исследования Молярное отношение МеиАсЛЗаІ МИТ, МИН Время полувыведения, мин Источник
рчБуХЭ Трансгенные растения Тетрамер Мыши — — 7±1 (94]
рчБуХЭ Трансгенные растения Тетрамер Морские свинки — — 24 [94]
рчБуХЭ- ПЭГ5* Трансгенные растения Тетрамер Мыши 3475±522 [94]
рчБуХЭ- ПЭГ20 Трансгенные растения Тетрамер Мыши - - 786±132 [94]
рмБуХЭ Мыши Тетрамер Мыши — 3960±84 564±30 [101]
рмБуХЭ Клетки СНО Тетрамер Мыши - 1806±102 510±36 [101]
рмБуХЭ- ПЭГ20 Клетки СНО Тетрамер Мыши — 2178±78 630±18 [101]
рмБуХЭ Клетки СНО Мономер Мыши — 1650±42 494±36 [101]
рмБуХЭ- ПЭГ20 Клетки СНО Мономер Мыши — 1980±36 468±36 [101]
чБуХЭ Плазма крови человека Тетрамер Мыши — 2742±102 1068±18 [97]
рчБуХЭ Клетки НЕК-293А Тетрамер Мыши — 1098±102 342±12 [97]
рчБуХЭ- ПЭГ20 Клетки НЕК-293А Тетрамер Мыши — 2171±120 780±60 [97]
чБуХЭ Плазма крови человека Тетрамер Мыши — 2712±48 750±36 [66]
рчБуХЭ Клетки НЕК-293А Мономер Мыши — 192±18 54±6 [66]
рчБуХЭ- ПЭГ20 Клетки НЕК-293А Мономер Мыши 1884±324 888±114 [66]
чБуХЭ Плазма крови человека Тетрамер Мыши 0,92 2791 1683 [98]
рчБуХЭ Клетки СНО Мономер+Димер Мыши 0,85 205±62 114±36 [98]
чБуХЭ Плазма крови человека Тетрамер Мыши 0,55 1437±323 845±43** [9В]
чБуХЭ, обработанная нейрамидазой Плазма крови человека Тетрамер Мыши -0 164±64 103±47" [98]
чБуХЭ, обработанная гликозидазой Плазма крови человека Тетрамер Мыши -*0 134±27 108±39** [98]
рчБуХЭ А328Л/*** Клетки СНО Мономер+Димер Мыши — — 2±1 [96]
рчБуХЭ А328Л/2 Клетки СНО Тетрамер Мыши — 1269 936±120 [96]
рчБуХЭ Трансгенные козы Димер Морские свинки 1,1 — 390 |92]
рчБуХЭ* ПЭГ20 Трансгенные козы Димер Морские свинки 1,1 ~ 2652 |92]
Примечания: Типер-пегилированный фермент; "Рассчитано по приведенным данным; "’Мутация в активном центре БуХЭ