Мультиплексный анализ аллерген-специфических иммуноглобулинов человека на биологическом микрочипе

• Автор: Фейзханова, Гузель Усмановна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 90 с. : ил.

Оглавление

Список сокращений

1 Введение

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Аллергические реакции

2.1.1 Аллергические реакции I типа

2.1.2 Аллергические реакции II типа

2.1.3 Аллергические реакции III типа

2.1.4 Аллергические реакции IV типа

2.2 Методы аллергодиагностики

2.2.1 In vivo методы

2.2.2 In vitro методы
2.2.3 Анализ аллерген-специфических иммуноглобулинов на микрочипах
2.3 Биологические микрочипы
2.3.1 Белковые микрочипы
2.3.2 Методы иммобилизации белков на микрочипах
2.3.3 Гидрогелевые Микрочипы
3 Материалы и методы
3.1 Приборы и реактивы
3.2 Очистка экстрактов аллергенов
3.3 Осаждение белков ТХУ
3.4 Белковый электрофорез
3.5 Изготовление биочипов
3.6 Получение конъюгата антител с флуоресцентными красителями
3.7 Иммуноанализ на биологических микрочипах
3.8 Флуоресцентные измерения
3.9 Иммуноферментный анализ сывороток крови
3.9.1 Определение содержания общего IgE в сыворотке с помощью ИФА
3.9.2 Определение содержания slgE в сыворотке с помощью ИФА
4 Результаты и их обсуждение
4.1 Выбор аллергенов
4.2 Одновременное определение набора slgE на биочипе
4.2.1 Подбор условий иммобилизации аллергенов
4.3 Разработка метода одновременного анализа slgE на биочипе
4.4 Количественное определение slgE и общего IgE

4.4.1 Использование для расчета концентраций * б^Е «статистических» калибровочных кривых
4.4.2 Расчет концентраций з^Е при помощи калибровочной кривой для общего ^Е
4.5 Анализ частоты встречаемости аллергических заболеваний
4.6 Анализ индивидуальных аллергенных белков на биочипе
4.7 Количественное определение 22-х на биочипе
4.8 Оценка аналитических характеристик метода
4.9 Сравнение разрабатываемого метода с коммерческой референсной тест-
системой
5 ВЫВОДЫ
6 Благодарности
7 Список литературы

Список СОКРАЩЕНИЙ
Bind Silane - (З-метоксисилил)пропилметакрилат ELISA - твердофазный иммуноферментный анализ IgE - иммуноглобулин Е
ITAM - иммунорецепторный тирозин-активируемый мотив MAST - множественный аллергосорбентный тест МНС - главный комплекс гистосовместимости PBS - фосфатно-солевой буфер
PBST - фосфатно-солевой буфер с 0,1% содержанием Tween-
PVA - поливиниловый спирт
PVP - поливинилперилидон
RAST - радиоаллергосорбентный тест
ROC-анализ - анализ с применением характеристических кривых (ROC-кривых)
slgE - аллерген-специфический иммуноглобулин Е
TEMED - тетраметилэтилендиамин
АПК - антиген-презентирующие клетки
АПК - антиген-презентирующие клетки
АСИТ - аллерген-специфическая иммунотерапия
БСА - бычий сывороточный альбумин
ДСН - додецилсульфат натрия
ИМБ РАН - Институт Молекулярной Биологии им. В.А. Энгельгардта РАН
ИФА - иммуноферментный анализ
КВ - коэффициент вариации
ME - международные единицы
ПААТ - полиакриламидный гель
ТХУ - трихлоруксусная кислота
ЭР - эндоплазматический ретикулум

иммобилизацией. Таким образом, условно получаемые микрочипы можно называть планарными микрочипами, или 2Э-микрочипами. Планарная иммобилизация не всегда эффективна, особенно при иммобилизации нестабильных молекул, так как поверхностная концентрация молекулярных зондов обычно достаточно низка и контакты с поверхностью значительно влияют на структурно-функциональные свойства иммобилизованного соединения.
Альтернативой являются микрочипы на основе гидрогелей. Слайд с гелевым покрытием (например, на основе полиакриламидного геля) обеспечивает лучшую эффективность иммобилизации за счет разветвленной структуры матрицы и создания более предпочтительного для термодинамически нестабильных биологических макромолекул окружения [137,139].
На рынке представлены микрочипы компании Perkin Elmer (США), в которых иммобилизация зондов осуществляется их нанесением на подложку, покрытую слоем полиакриламидного геля толщиной 30 мкм. Аналогично, используемые в системах Biacore (Швеция) сенсочипы имеют двойную модификацию поверхности - стекло с золотым покрытием дополнительно модифицировано полисахаридными гелями.
Используемые методы иммобилизации молекул на модифицированных гелями поверхностях не позволяют с достаточной результативностью использовать разветвленную структуру гидрогелей. Нанесение зондов на активированную гидрогелевую матрицу сопряжено с двумя параллельно протекающими процессами - диффузией вещества в гель и непосредственно реакциями иммобилизации. Так как химические реакции протекают быстрее диффузионных процессов, иммобилизация протекает преимущественно в приповерхностном слое [129,140].
Принципиально иная технология разрабатывается в Институте Молекулярной Биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (ИМБ РАН), основанная на одновременном формировании гидрогелевых ячеек с иммобилизацией молекулярных зондов. При этом молекулярные зонды равномерно распределены по всему объему ячейки. За счет развитой поверхности гидрогеля молекулярные