Анализ девяти серологических онкомаркеров на гидрогелевом биочипе

• Автор: Зубцова, Жанна Исхаковна
• Шифр специальности: 03.01.03, 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 114 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общая характеристика микрочипов.

1.2. Применение микрочипов.

1.3. Изготовление микрочипов.

1.3.1. Методы иммобилизации белков на микрочипах.

1.3.2. Методы нанесения зондов

1.4. Микрочипы на основе гидрогелей.

1.5. Опухолевые маркеры.

1.5.1. Индивидуальные опухолевые маркеры
1.5.1.1. Альфафстопротсии
1.5.1.2. Хорионический гонадотропин человека
1.5.1.3. Раковоэмбриональный антиген.
1.5.1.4. Опухолеассоциированный антиген 5
1.5.1.5. Опухолеассоциированный антиген СА 3
1.5.1.6. Опухолеассоциированный антиген СА 9
1.5.1.7. Нейронспецифическая енолаза.
1.5.1.8. Простатспецифический антиген
1.5.2. Одновременное определение нескольких онкомаркеров
1.6. Белковые микрочипы для определения онкомаркеров
1.7. Усиление флуоресценции вблизи металлической поверхности
1.8. Усиление флуоресценции на микрочипах с металлическим напылением
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
2.1. Приборы и реактивы.
2.2. Буферные растворы.
2.3. Приготовление коныогагов флуорссцснтномеченных проявляющих
антител и их смеси
2.4. Приготовление калибровочных проб.
2.5. Изготовление белковых микрочипов.
2.6. Сэндвич иммуноанализ на биочилах.
2.7. Флуоресцентные измерения.
2.8. Обработка результатов анализа
2.9. Аналитические характеристики метода
2.9.1. Воспроизводимость анализа
2.9.2. Аналитическая чувствительность предел обнаружения
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Биочип для одновременного количественного анализа девяти онкомаркеров
3.2. Выбор объектов для одновременного количественного анализа
3.3. Разработка процедуры одновременного количественного анализа девяти
онкомаркеров
3.3.1. Воспроизводимость анализа
3.3.2. Аналитическая чувствительность предел обнаружения
3.4. Определение содержания девяти онкомаркеров в сыворотках крови
3.5. Группировка онкомаркеров в соответствии с диагнозами.
3.6. Микрочипы на металлизированных подложках.
3.7. Выявление факторов, определяющих усиление сигнала
3.7.1. Природа иммобилизованного зонда
3.7.2. Тип металлизированного покрытия и тип красителя
3.7.3. Влияние формы ячейки.
3.7.4. Концентрация иммобилизованного флуорофора
3.7.5. Влияние слоя жидкости
3.7.6. Механизм усиления флуоресценции
3.7.7. Флуоресцентное изображение гелевых ячеек на гидрофильных и
гидрофобных металлизированных подложках.
3.8. Оптимизация иммуноанализа на микрочипах с металлическим напылением
ВЫВОДЫ.
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Белковые микрочипы также позволяют количественно анализировать уровень белка, специфичного к иммобилизованному в ячейке зонду в образце в клеточном, экстракте, сыворотке крови и других биологических жидкостях. Такой тип микрочипов выступает в роли аналитического инструмента ,, , . Широко известны двумерные белковые микрочипы, у которых молекулы белков химически или сорбционно закреплены непосредственно на специально обработанной стеклянной или другой поверхности. В лаборатории белковых микрочииов ИМБ РАН активно разрабатываются микрочипы на основе трехмерных гидрогелей. Возможность применения микрочипов в протеомных исследованиях продемонстрировали 2Ьи и другие . Авторы провели выделение и очистку различных рекомбинантных белков из З. Используя кальмодулин как модельную пробу для анализа, они подтвердили уже известные взаимодействия, кроме того, был обнаружен ряд новых кальмодулинсвязывающих белков. Диагностическое применение микрочипов очень важно для медицинских исследований. К примеру, диагностика онкологических заболеваний является ключевой проблемой онкологии. Соединения, которые продуцируются опухолью или организмом в ответ на развитее опухоли, называют опухолевыми маркерами. Концентрация этих соединений в крови обычно коррелирует с размером опухоли и стадией заболевания, и, кроме того, позволяет дифференцировать злокачественные и доброкачественные опухоли. Чаще всего диагностическая специфичность и. В литературе описаны микрочипы, при помощи которых можно определить содержание нескольких онкомаркеров в пробе , , , , . Определение уровня биотоксинов и патогенов в образце в пище, в. Главной проблемой в этом направлении остается большой спектр возможных токсинов и патогенов и ограничение времени проведения анализа. С помощью белковых микрочипов с иммобилизованными антителами против токсинов и патогенов обе проблемы становятся легко преодолимыми. Такие биочипы позволяют не только определить наличие вредных веществ в образце, но и количественно измерить их содержание ,,,. Более населения Земли страдает от различных видов аллергий. Плохая экология и социальные проблемы с каждым днем прибавляют к этой группе все большее число людей. Кожный тест является классическим способом определения вещества, вызывающего аллергию. Однако, изза большого количества известных аллергенов очень сложно поставить правильный диагноз, не подвергая пациента риску гиперсснсебилизащш. Е в крови пациента , , . Таким образом, при помощи белковых микрочипов исследуются взаимодействия между белками в клетках, плазме и тканях, определяют различные химические вещества в организме , , . Иммобилизацию белковых молекул можно осуществлять как на поверхности подложки кремний, кварц, макропористые стекла, силикагель, нитроцеллюлоза, магнитные носители и др. Для создания подложек могут применяться как исмодифицироваиные носители, так и химически модифицированные , , . Наиболее часто используются химически обработанные стекла или пластик , США, пористые гели, прикрепленные к поверхности стекла i , США и полистирольпые плашки для сорбции белка , Дания , , , , . Иногда используются различные мембраны, позолоченные поверхности, иитроцеллюлозные фильтры, кремний. Методы иммобилизации белковых молекул можно разделить па три основные группы физическая, химическая иммобилизация и иммобилизация за счет комплексообразования. Физическую иммобилизацию осуществляют за счет адсорбции молекулы на носителе ионные и гидрофобные взаимодействия, а также образование водородных связей. В качестве носителей используют различные субстраты например, стекло, нейлон, полистирол , , кроме того, для увеличения плотности иммобилизации используют пористые среды фильтры, полиакриламидный гель, различного рода мембраны, пористые стекла, силохромы 8, , . К недостаткам физической адсорбции белков на микрочипах следует отнести произвольную ориентацию белков и их слабое связывание с подложной, при этом большая плотноегь белков может привести к стсрической блокировке активных сайтов.