Гидроксилирование свободных L-аминокислот в бактериях

• Автор: Соколов, Павел Михайлович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 110 с. : ил.

Оглавление
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
1. ВВЕДЕНИЕ
1.1. Актуальность проблемы
1.2. Цели и задачи работы
1.3. Научная новизна и практическая значимость работы
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Введение: Актуальные аспекты социального поведения бактерий
2.1. QS в онтогенезе бактериальной биопленки
2.1.1. Механизмы и факторы связывания бактериальных клеток планктонного типа с колонизируемой поверхностью
2.1.2. Сравнительный анализ молекулярных механизмов регуляции QS
2.1.3. РольЦБ в регуляции вирулентности патогенных бактерий
2.1.4. Система QS как мишень для антибактериальной терапии
2.1.5. Дезинтеграция биопленки как заключительный этап ее эволюции
2.2. QS и взаимодействие бактерий с их биологическими векторами
2.2.1. Биолюминесценция как сигнал к "эвакуации" у морских бактерий
2.2.2. Механизмы привлечения биологических векторов фитопатогенными растениями
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Бактериальные штаммы и плазмиды
3.2. Среды и условия культивирования штаммов
3.3. Генно-инженерные методики
3.3.1. Проведение ПЦР
3.3.2. Проведение Red-зависимой интеграции линейных фрагментов ДНК в бактериальную хромосому
3.4 Конструирование штаммов и плазмид
3.4.1. Конструирование плазмид pET-HT-IDO, рЕТ-НТ-РАА, pET-HT-MFL и pET-HT-GOX
3.4.2. Конструирование плазмид pET-HT-AVI, рЕТ-НТ-ВРЕ, pET-HT-GVI и pET-HT-PLU
3.4.3. Конструирование плазмиды pQE80L-HT-NPU
3.4.4. Конструирование плазмид рЕТАС-НМА и pETAC-HilAB
3.4.5. Конструирование плазмиды pELAC-AVI
3.4.6. Конструирование штамма MG1655 АpdxB
3.4.7. Конструирование штамма MG1655 ApdxBAthrC

3.4.8. Конструирование штамма MG1655 ApdxBMhrB
3.5 Экспрессия и очистка рекомбинантных белков
3.5.1. Экспрессия и очистка His6-tag белков
3.5.2. Синтез и очистка HilA
3.6. Исследование ферментативной активности
3.6,1 Скрининг субстратной специфичности
3.6.2. Определение кинетических параметров реакций гидроксилирования
3.6.3. Определение специфической активности HilA и HilB в клеточных лизатах
3.7. Определение структуры гидроксилированных L-аминокислот
3.7.1. Биосинтез и частичная очистка 4-гидроксилейцина
3.7.2. Биосинтез и частичная очистка сульфоксида L-метионина
3.7.3. Биосинтез и частичная очистка L-4-гидрокситреонина
3.7.4. Биосинтез и частичная очистка L-4-гидроксивалина
3.7.5. Биотрансформация L-изолейцина в 4'-гидроксиизолейцин (4'-HIL) и 4, 4'-дигидроксиизолейцин (4,4'-DIHIL)
3.7.6. Биосинтез и частичная очистка 4'-HIL
3.7.7. Биосинтез и частичная очистка 4’, 4-DIHIL
3.7.8. ВЭЖХ и ТСХ анализ гидроксилированных L-аминокислот
3.7.9. ВЭЖХ-МС-анализ, ЭСИ-МС-анализ и ЯМР спектроскопия гидроксилированных L аминокислот
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
4.1. Эвристический поиск вероятных Ре(И)/а-кетоглутарат-зависимых диоксигеназ свободных L-аминокислот среди белков Pfam семейства PF10014
4.2. Клонирование генов-кандидатов, их экспрессия в E. coli и очистка соответствующих рекомбинантных белков
4.3. Определение субстратной специфичности гомологов IDO
4.4. Определение кинетических параметров ферментативных реакций, катализируемых гомологами IDO
4.5. Гидроксилирование L-треонина в бактериях как альтернативный путь биосинтеза витамина В6
4.6. Уникальный окислительный каскад из Pantoea ananatis AJ13355
4.7. Перспективы дальнейших исследований гидроксилирования свободных L-аминокислот: гипотезы о его физиологической роли в бактериях
5. ВЫВОДЫ
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.
AHL - N-ацил-гомосерин лактон
QS - “чувство кворума” (от англ. Quorum Sensing)
QQ - “ослабление кворума” (от англ. Quorum Quenching)
DTT - дитиотреитол (я?рео-2,3-дигидрокси-1,4-димеркаптобутаи) GFP - зеленый флюоресцирующий белок (green fluorescent protein). E.coli — Escherichia coli СП - социальное поведение
JIKCM - лазерная сканирующая конфокальная микроскопия TFP - пили IV типа
IDO - Ь-изолейцин-4-гидроксилаза (диоксигеназа)
IPTG (ИПТГ) - изопропил — p-D-тиогалактопиранозид
RBS - участок связывания рибосом
SDS - додецилсульфат натрия
ПААТ - полиакриламидный гель
ПЦР - полимеразная цепная реакция
X-gal - 5-бромо-4-хлоро-3-индоил-бета-0-галактопиранозид
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
ТСХ - тонкослойная хроматография
МС - масс-спектрометрия
ЭСИ - ионизация распылением в электрическом поле

др. В патогенезе ведущую роль играют токсины, оказывающие как местное, так и общее действие. Большое значение имеют также инвазивные свойства синегнойной палочки, которые способствуют быстрому развитию бактериемии (цитировано по.
В отличие от S. aureus, у P. aerugenosa система QS (см. выше рис. 11) одновременно стимулирует образование биопленки и синтез факторов вирулентности. Системы автоиндукции LasI/LasR и Rhll/RhlR активируют синтез таких факторов вирулентности как эластазы, протеазы, экзотоксин, рамнолипид, пиоцианин, лектины и супероксид дисмутазы [95, 96]. На многочисленных животных моделях было показано, что мутанты lasl и lasR оказывают менее деструктивное воздействие на ткани инфицированного животного, по сравнению с клетками дикого типа. Соответственно, наблюдалось уменьшение смертельных случаев при заражении клетками с инактивированным QS.
В экспериментах с мутантными клетками было показано, что система LasI/LasR регулирует образование биопленки с самых ранних стадий ее формирования. Клетки с инактивированным геном lasl были не в состоянии сформировать структуру зрелой биопленки [97].
Интересно отметить, что молекула автоиндуктора P. aerugenosa 30C12-HSL (см. Рис. 11) сама по себе является биологически активной молекулой. Было показано, что вследствие прямого контакта с клетками бронхиального эпителия 30C12-HSL индуцирует экскрецию ими интерлейкина-8 [98]. Кроме того, он ингибирует пролиферацию лимфоцитов, синтез фактора некроза опухолей (TNF-а) и интерлейкина-12 [99, 100]. 30C12-HSL способен индуцировать апоптоз макрофагов и нейтрофилов. Таким образом, автоиндуктор 30C12-HSL, помимо своей регуляторной роли, сам является фактором вирулентности, действующим на иммунную систему человека [101]. (Аналогичная ситуация наблюдается и в случае фитопатогенных бактерий, в которых индукция синтеза факторов вирулентности, разрушающих ткани растений, также регулируется системой QS [53,60, 102-105].