Поиск путей транспорта D-глюкозы в клетки Escherichia coli, альтернативных фосфоенолпируват-зависимой фосфотрансферазной системе

• Автор: Сливинская, Екатерина Александровна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 93 с. : ил.

Оглавление
1. Введение

II. Обзор литературы
^Бактериальная цитоплазматическая мембрана и мембранные белки
1.1.Строение и функции цитоплазматической мембраны б
1.2. Мембранные белки
1.3. Функции мембранных белков
1.4. Перенос различных веществ через цитоплазматическую мембрану и транспортные белки
2.Активный транспорт углеводов внутрь клетки и фосфоенолпируват- 13 зависимая фосфотрансферазная система
2.1. Белки PTS
2.1.1. EI
2.1.2. НРг
2.1.3. Глюкозо-специфические белки
2.2. Хромосомная организация генов PTS
2.3. Регуляторная роль PTS
2.4. Регуляция синтеза белков PTS
3. PTS- независимый транспорт углеводов в клетку E.coli
3.1. MFS-суперсемейство мембранных транспортеров
3.2. GalP - Н+/симпортер D-галактозы
3.3. Суперсемейство АВС-транспортеров
4.Использование PTS-независимого транспорта при создании 44 высокоэффективных продуцентов
III. Материалы и методы
IV. Результаты и обсуждение
1. Разработка методического подхода для оценки способности PTS-
независимых транспортных систем к переносу глюкозы на примере пермеазы галактозы GalP
1.1. Конструирование штамма E. coli MG1655 с делецией генов PTS
1.2. Обеспечение конститутивной экспрессии гена galP.
1.3. Оценка способности пермеазы галактозы GalP к транспорту D-глюкозы

внутрь клетки.
1.4. Изучение транспорта D-глюкозы в клетках дефектного по PTS штамма E.coli с разным уровнем экспрессии гена galP.
1.5. Влияние увеличения активности глюкокиназы на рост PTS' штамм; E.coli с конститутивной экспрессией гена gal Р.
1.6. Влияние амплификации гена ybiV на рост штамма MGdel с сильно! экспрессией генов galP и gl к в минимальной среде с глюкозой.
2. Идентификация новых PTS-независимых систем транспорта углеводов, способных к переносу D-глюкозы внутрь клетки.
2.1. Выбор PTS-независимых транспортеров, потенциально способных к переносу D-глюкозы.
2.2. Обоснование выбора XylE как потенциального транспортера глюкозы.
2.3. Изучение роста PTS’ штамма E.coli с различным уровнем экспрессии гена xylE на среде с глюкозой
2.4. Исследование транспорта глюкозы клетками PTS" штамма с
конститутивной экспрессией гена xylE.
2.5. Влияние увеличения активности глюкокиназы на рост PTS' штамма ( конститутивной экспрессией гена xylE.
2.6. Оценка способности других PTS-независимых транспортеров сахаров i переносу D-глюкозы внутрь клетки.
2.7. Исследование транспорта глюкозы клетками PTS' штамма с
конститутивной экспрессией генов alsABC, araFGH, fucP.
3. Влияние PTS-независимого транспорта глюкозы на синтез некоторы; аминокислот штаммами-продуцентами.
Заключение
V. Выводы
VI. Список литературы

I. Введение
Актуальность темы. Escherichia coli широко используется в производстве ряда биологически активных веществ, в том числе аминокислот, применяемых в различных отраслях — пищевой, кормовой, фармацевтической промышленности. Для создания высокоэффективных штаммов-продуцентов методами метаболической инженерии требуется детальное изучение основных метаболических процессов, протекающих в микробной клетке, в число которых входит и перенос веществ через цитоплазматическую мембрану.
D-глюкоза применяется в микробиологическом производстве в качестве источника углерода для накопления бактериальной биомассы и биосинтеза биологически активных соединений. Показано, что у ряда продуцентов недостаточная эффективность транспорта глюкозы в клетку является фактором, ограничивающим продуктивность.
Известно, что в клетках Е. coli основной путь утилизации D-глюкозы начинается с ее транслокации через цитоплазматическую мембрану и фосфоршшрования (с образованием D-глюкозо-б-фосфата), осуществляемых фосфоенолпируват:углевод фосфотрапсферазной системой (PTS) с использованием фосфоенолпирувата (РЕР) в качестве донора фосфатной группы. При этом на долю PTS приходится 50% пула фосфоенолпирувата, в то время как на долю основных биосинтетических ферментов, использующих РЕР как субстрат, - фосфоенолпируваткарбоксилазы, пируваткиназы, уридиндифосфат-М-ацетилглюкозамшг-енолпирунил-трансферазы и 3-деокси-Е)-арабино-гептулозонат-7-фосфатсинтазы - 16, 15, 16, 3%, соответственно (122).
К настоящему времени большинство работ, посвященных увеличению эффективности транспорта глюкозы в клетку, было связано именно с модификацией акгивности PTS (24). Однако, транспорт через эту систему не выгоден в тех случаях, когда расходующийся на перенос и фосфорилирование глюкозы, фосфоенолпируват одновременно является прямым метаболическим предшественником целевого продукта (к примеру, аминокислот аспарагинового семейства). Таким образом, экономия РЕР вследствие использования клетками альтернативных PTS-независимых систем транспорта глюкозы, имеет очевидные преимущества для подобных процессов (18,34,47).
На момент начала работы были известны две PTS-независимые системы транспорта моносахаров Е. coli, способные к переносу глюкозы. Это GalP - низкоафинный Н+-симпортер (пермеаза) D-галактозы (46), который из-за схожести пространственной структуры, субстратной специфичности и способности к ингибированию некоторыми антибиотиками часто рассматривают в качестве бактериального аналога пассивного

несколько модификаций гена sgrS — часть плазмид содержала только область связывания с мРНК( р1зС), часть - sgrT, часть - целый sgrS. Было показано, что при стрессе, вызванном накоплением метилгликозида, подавляется рост клеток с делецией sgrS, в то время как штамм, несущий дикий БдгБ либо два усеченных варианта, продолжали расти. Обратный эффект был получен в случае роста клеток на глюкозе в качестве единственного источника углерода - суперэкспрессия усеченных вариантов и полноразмерного Б^Б подавляла рост на глюкозе. Т.е в SgrS имеет две функции, влияющие на транспорт глюкозы в условиях стресса, причем, БргТ работает независимо от взаимодействия с мРНК( р1зО). Предположили, что БцгТ ингибирует активность уже действующего Р^С, т.е. выступает как посттрансляционный регулятор активности. Косвенно это подтверждается следующим: фермент ЕПА фосфорилируется и является регулятором экспрессии катаболитных оперонов. В дефосфорилированной форме он связывается с пермеазами ряда оперонов, к примеру, лактозного, что приводит к исключению индуктора. Если БёгТ ингибирует транспорт глюкозы в клетку через Р1зО - повышается уровень фосфорилтрованной ЕПА и снимается репрессия гапактозидазы в клетках, растущих на глюкозо- лактозной смеси. И действительно, амплификация SgrT в клетках с делецией ххгК приводит к значительному повышению уровня галактозидазной активности, то есть, SgrT влияет на транспорт глюкозы, изменяя активность транспортера, закрывая транспортный канал или ингибируя фосфорилирование ГЧэС на основании белок-белкового взаимодействия. Таким образом, БцгБ представляет собой двойной регулятор, предотвращающий синтез нового транспортера и ингибирующий транспорт через существующий канал.
Общая же картина посттранскрипционной регуляции синтеза выглядит следующим образом: При накоплении в клетке сахарофосфатов происходит индукция Б§гЯ, который активирует экспрессию sgrS. SgrS ассоциируя с Hfq и деградосомой, связывается с мРНК^эО), блокируя трансляцию и вызывая её деградацию. Параллельно на 5'-конце sgl■S происходит синтез белка Б§гТ, который инактивирует уже существующий в клетке ЕПВС. Таким образом, полностью блокируется накопление в клетке токсического количества сахарофосфатов.
Исходя из всего вышесказанного можно заключить, что регуляция активности и функционирование фосфотрансферазной системы в клетке - чрезвычайно многофакторный и сложный процесс, который служит прежде всего для адаптации клетки к изменяющимся условиям внешней среды.