Влияние белков вируса гепатита C на регуляцию окислительного стресса и метаболизм биогенных полиаминов

• Автор: Смирнова, Ольга Александровна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 174 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Вирус гепатита С
Геном и протеом вируса гепатита С
Белок капсида
Гликопротеины оболочки Е1 и Е2
Белок р7
Белок N52
Белки N53 и 4А
Белок ИБЙВ
Белок ИБбА
Белок N556
Клеточные и животные модели репликации ВГС
Окислительный стресс
Система защиты от окислительного стресса
Цис- элементы, регулирующие клеточный ответ на окислительный стресс
Факторы транскрипции, регулирующие экспрессию АЯЕ-зависимых генов
Структура фактора транскрипции №12
Взаимодействие фактора транскрипции №12 с белком Кеар 1 в отсутствие
окислительного стресса

Регуляция активности фактора транскрипции Nrf2
Влияние вируса гепатита С на системы защиты клетки от окислительного стресса
Биогенные полиамины и регуляция их метаболизма
Функции орнитиндекарбоксилазы и регуляция ее активности
Регуляция и функции спермидин/спермин-Ш-ацетилтрансферазы
Функции полиаминоксидазы (АРАО) и регуляция ее активности
Функции сперминоксидазы и регуляция ее активности
Связь нарушений метаболизма полиаминов с различными заболеваниями
Заключение
Материалы и методы
Клеточные культуры
Приготовление компетентных клеток E
Трансформация бактериальных клеток
Препаративное выделение плазмид из клеток E.coli
Манипуляции с плазмидной ДНК
Полимеразная цепная реакция
Конструирование плазмид
Работа с клетками эукариот
Детекция АФК в клетках Huh7
Оценка уровня Н2О2 с использованием плазмид, кодирующих белок Hyper
Получение лизатов клеток Huh7 и измерение люциферазной активности
Измерение ß-галактозидазной активности в лизатах клеток Huh7

Western-blot гибридизация
Иммуноокрашивание
Обратная транскрипция и ПЦР в реальном времени
Подавление экспрессии генов при помощи коротких интерферирующих РНК
Подготовка образцов для измерения активности ODC и SSAT, а также и уровня полиаминов в клетках
Определение количества полиаминов
Определение активности ODC
Определение активности SSAT
Статистическая обработка результатов
РЕЗУЛЬТАТЫ
Влияние белков вируса гепатита С на индукцию окислительного стресса
Конструирование и характеризация плазмид
Белки El, Е2, NS4B, NS5A и белок капсида ВГС вызывают окислительный стресс
Выявление доменов белка капсида ВГС, отвечающих за индукцию окислительного стресса в клетках, и идентификация АФК-продуцирующих ферментов
Анализ состояния системы защиты клетки от окислительного стресса при экспрессии индивидуальных белков ВГС
Изучение механизма активации ARE/Nrf2 каскада в клетках, экспрессирующих белки ВГС
Выявление доменов белка капсида ВГС, отвечающих за активацию системы защиты от окислительного стресса, и анализ ее механизмов

Партнерами фактора Nrf2 являются белкиМаГ (Musleaponeuroticfibroblasloma) семейства. Взаимодействие некоторых из них с Nrf2 усиливает экспрессиюАКЕ-зависимых генов, в то время как связывание с другими, напротив, блокирует транскрипцию. Так, взаимодействие с MafK или MafG считается необходимым для активации экспрессии ARE-зависимых генов, хотя ихсуперэкспрессия приводит к подавлению экспрессии генов ответа на окислительный стресс [150, 151]. Белок этого же семейства c-Maf является отрицательным регулятором экспрессии генов защиты от окислительного стресса [152]. Недавно было показано, что ингибитором экспрессии ARE-зависимых генов может выступать и одна из сплайсированных форм Nrfl - p65Nrfl [153].
Структура фактора транскрипции Nrf2
Фактор транскрипции Nrf2 представляет собой белок, состоящий из 589 а.о. В его структуре выделяют шесть консервативных участков (Nehl-Neh6) [154, 155]. Домен Nehl (434-561 а.о.) содержит последовательность, необходимую для связывания ДНК и ассоциации с другими транскрипционными факторами [156]. В структуре второго домена (Neh2) можно выделить консервативный участок с 33 по 73 а.о, который обуславливает способность фактора Nrf2 связываться со своим основным регулятором - белком Keapl. Кроме того, данный фрагмент домена Neh2 содержит семь остатков лизина, необходимых для убиниквитилирования, приводящего к протеасомной деградации фактора [157]. Домен Neh3 (561-604 а.о.) предположительно является активатором транскрипции [158]. Функции остальных доменов изучены сравнительно мало.
Белок Nrf2 имеет несколько сигналов ядерного экспорта (NES) и ядерной локализации (NLS). Один NLS (494-511 а.о.) находится в домене Nehl, а еще два в N- и С-концевых доменах [159]. Сигналы ядерного экспорта расположены в доменах Nehl (537-546 а.о., основной сигнал), и Neh5 (175-186 а.о.) [156].