Инициация трансляции эукариотических мРНК на эффективных лидерах : зависимость от факторов инициации и структуры лидера

• Автор: Широких, Николай Эдуардович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 243 с. : ил.

Содержание
Титульный лист
Содержание
Список условных сокращений
Глава 1. Введение
Глава 2. Обзор литературы
2.1. Контроль экспрессии генов и биосинтез белка
2.1.1. Центральная догма молекулярной биологии
2.1.2'. Основные способы посттранскрипционной регуляции экспрессии
генов в цитоплазме эукариот.:
2.1.3. Регуляция экспрессии генов во время трансляции мРНКу эукариот
2.2. Инициация трансляции у эукариот
2.2.1. Отличие инициации от других этапов трансляции мРНК
2.2.2. Инициация трансляции у эукариотических организмов: ключевые участники процесса
2.2.3. Общепринятая модель инициации трансляции мРНК клеточного происхождения у эукариот
2.3. Задачи исследования
Глава 3. Материалы исследования
3.1. Оборудование
3.2. Химические реагенты
3.3. Ферменты
3.4. Буферные растворы и микробиологические среды
3.5. Генетические конструкции
3.6. ДНК-олигонуклеотиды
3.7. Штаммы клеток
3.8. Программные инструменты
Глава 4. Методы исследования
4.1. Стандартные методики
4.2. Получение компетентных клеток Escherichia coh штаммов DH5a и B!.21(DE3)
4.3. Трансформация компетентных клеток Escherichia coli
плазмидными векторами
4.4. Электрофорез нуклеиновых кислот в неденатурирующем агарозном геле
4.5. Очистка ДНК-плазмид
4.6. Очистка ДНК-плазмид без использования РНКаз
4.7. Очистка ДНК-плазмид от низкополимерных нуклеиновых кислот
4.8. Препаративная рестрикция плазмид и фрагментов ДНК
4.9. Препаративное разделение и очистка фрагментов ДНК разной длины с помощью электрофореза в неденатурирующем агарозном геле
4.10. Отщепление 5'-концевых фосфатных групп от фрагментов ДНК после их расщепления рестриктазами
4.11. Отжиг комплементарных участков цепей синтетических олигонуклеотидов для последующего встраивания двуцепочечного фрагмента ДНК в плазмидный вектор с помощью лигирования
4.12. Амплификация фрагментов ДНК с помощью полимеразой цепной реакции
4.13. Фосфорилироеание 5'-концов двуцепочечных [фрагментов ДНК с помощью полинуклеотидкиназы
4.14. Лигирование фрагментов ДНК
4.15. Секвенирование плазмид и фрагментов ДНК
4.16. Конструирование плазмиды рп
4.17. Конструирование плазмиды pTZA25Luc
4.18. Конструирование плазмид pTZMlLuc, pTZM2Luc, pTZM3Luc
4.19. Конструирование плазмиды pTZflX2FRLuc
4.20. In vitro транскрипция
4.21. Осаждение фрагментов РНК длиной от 20 нт с минимальным соосаждением свободных нуклеотидов
4.22. Гель-фильтрация макромолекул РНК или ДНК для очистки от низкомолекулярных примесей
4.23. Гель-филътрационное разделение молекул РНК
4.24. Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот в денатурирующем полиакриламидном геле
4.25. Неполный щелочной гидролиз РНК
4.26. Препаративное электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот в денатурирующем полиакриламидном геле
4.27. Электрофорез РНК в агарозном геле в солевых условиях, близких к
• физиологическим
4.28. Модификация РНК диметилсульфатом
4.29. Модификация РНК диэтилпирокарбонатом
4.30. Расщепление РНК РНКазой VI
4.31. Расщепление РНК РНКазой А
4.32. Обратная транскрипция РНК после частичной модификации или расщепления
4.33. Капиллярный электрофорез, считывание флуоресценции и анализ сигнала от разделенных кДНК-транскриптов модифицированной или расщепленной РНК
4.34. Аналитическое ультрацентрифугирование водных растворов РНК
4.35. Тепловое плавление РНК, измеренное по изменению абсорбции света на длине волны 258 нм
4.36. ЯМР-спектрометрия водных растворов РНК
4.37. Получение лизата ретикулоцитов кролика
4.38. Удаление эндогенных мРНК из лизата ретикулоцитов кролика с помощью обработки микрококковой нуклеазой
4.39. In vitro трансляция
4.40. Осаждение фракции белков из реакционной смеси для in vitro трансляции, нерастворимой в трихлоруксусной кислоте
4.41. Подсчет количества радиоактивности во фракции белков трансляционной смеси, осажденных на бумаге трихлоруксусной кислотой
4.42. Ионообменная хроматография белков на колонке, содержащей диэтиламиноэтил-целлюлозу
4.43. Ионообменная хроматография белков на колонке, содержащей фосфоцеллюлозу
4.44. Ионообменная хроматография белков на колонках Mono-Q и Mono-S
4.45. Аффинная очистка белков на колонке с Ni-NTA агарозой
4.46. Аффинная очистка белков на колонке с 7тСТР-сефарозой
4.47. Концентрирование белков, рибосом и их субъединиц ультрафильтрацией
4.48. Диализ рибосом, субъединиц рибосом и белков
4.49. Осаждение белков ацетоном в целях их концентрирования и удаления ионов К'* из раствора
4.50. Электрофоретическое разделение белков в денатурирующем полиакриламидном геле
4.51. Выделение факторов инициации трансляции elF2, eIF3, eIF3-eiF4F из лизата ретикулоцитов кролика
4.52. Выделение субъединиц рибосом из лизата ретикулоцитов кролика
4.53. Выделение мРНКß-глобина из лизата ретикулоцитов кролика
4.54. Экспрессия рекомбинантных плазмид, кодирующих факторы инициации трансляции млекопитающих и инициаторную аминоацил-тРНК синтетазу Escherichia coli, в клетках Escherichia coli, и очистка соответствующих белков.
4.55. Подсчет радиоактивности в срт в водных растворах, содержащих радиоактивно меченые белки или нуклеиновые кислоты
4.56. Визуализация и оценка радиоактивности изотопов в полиакриламидном геле после электрофоретического разделения белков или нуклеиновых кислот

4.57. Аминоацилирование инициаторной тРНКмлекопитающих рекомбинантной аминоацил-тРНКсинтетазой Escherichia coli
4.58. Аминоацилирование тотальной тРНК по Met, Val, His и Leu
4.59. Сборка инициаторных комплексов эукариот из очищенных компонентов
in vitro
4.60. Сборка инициаторных комплексов эукариот в нефракционированном лизате ретикулоцитов кролика, обработанном микрококковой нуклеазой, in vitro
4.61. Реакция удлинения пептида в мРНК-рибосомных комплексах эукариот, собранных из очищенных компонентов in vitro
4.62. Сборка и очистка пре-терминационного комплекса трансляции эукариот из очищенных компонентов in vitro
4.63. Реакция терминации трансляции в мРНК-рибосомных комплексах эукариот, собранных из очищенных компонентов in vitro
4.64. Реакция ингибирования удлинения праймера мРНК-рибосомными комплексами эукариот (тупринтинг)
4.65. Анализ флуоресцентно меченых кДНК, полученных в реакции тупринтинга, капиллярным электрофорезом на автоматическом секвенаторе
Глава 5. Результаты и обсуждение результатов работы
5.1. Улучшенный метод ингибирования удлинения праймера рибосомными комплексами на мРНК (тупринтинг)
5.1.1. Основы метода ингибирования удлинения праймера
5.1.2. Стандартный метод ингибирования удлинения праймера рибосомными комплексами на мРНК
5.1.3. Метод ингибирования удлинения праймера рибосомными комплексами на мРНК с использованием флуоресцентной метки и капиллярного электрофореза
5.1.4. Оптимизация условий обратной транскрипции для реакции тупринтинга
5.1.5. мРНК-рибосомные комплексы, которые могут быть исследованы методом ингибирования удлинения праймера
5.1.6. Обнаружение рибосомных комплексов на мРНК
5.1.7. Анализ электрофореграмм, полученных методом тупринтинга с флуоресцентной меткой
5.1.8. Оптимизация выхода инициаторных мРНК-рибосомных комплексов для реакции тупринтинга
5.1.9. Идентификация мРНК-рибосомных комплексов методом тупринтинга с флуоресцентной меткой
5.1.10. Расчет эффективности реакций инициации, элонгации и терминации трансляции методом флуоресцентного тупринтинга
5.1.11. Обнаружение нескольких мест сборки мРНК-рибосомных комплексов в одной и той же реакционной смеси с помощью метода тупринтинга
5.1.12. Общая характеристика улучшенного метода тупринтинга с применением флуоресцентной метки и капиллярного электрофореза
5.1.13. Заключение
5.2. Инициация трансляции на мРНК с поли(А)-лидером - 5' нетранслируемой
, последовательностью мРНК осповирусов
г 5.2.1. Общее представление о развитии осповирусов в клетке хозяина
I 5.2.2. Особенности структуры и биосинтеза мРНК осповирусов
5.2.3. мРНК с поли (А) лидерами эфнфективно транслируются в зараженной
* осповирусами клетке и in vitro
5.2.4. Поли(А)-лидеры обеспечивают эффективную инициацию трансляции мРНК без факторов инициации группы eIF4 и мультисубъединичного белка eIF3
! 5.2.5. мРНК с поли(А)-лидерами обладают конкурентным преимуществом в
{ трансляции по сравнению с обычными клеточными мРНК

вторичных структур РНК. В предложенной недавно A.C. Спириным модели, переменная аффинность eIF4A к мРНК, свойства eIF4F и eIF4B используются для создания направленного, потребляющего энергию гидролиза АТФ движения инициирующей рибосомы по 5'-нетранслируемой области мРНК, которое включает в себя расплетание вторичных структур, оказывающихся на пути рибосомы (рассмотрено в следующем разделе) [272].
eIF4A может фосфорилироваться, и его фосфорилирование сопряжено с разными фазами дифференцировки и тепловым шоком клеток, однако влияния фосфорилирования на эффективность трансляции не установлено [164, 315-317]. Уровень представленности разных изоформ eIF4A зависит от типа ткани [318-320]. eIF4AI/II высших эукариот не совместим с eIF4G дрожжей, что еще раз указывает на довольно сильную разницу в белках, относящихся к аппарату сканирования между высшими и низшими эукариотами [275]. Возможно, eLF4A может участвовать и в других процессах, помимо вышеназванных. Чрезвычайно высокое содержание eIF4A в цитоплазме, а также обилие других близкородственных хеликаз в клетке, в том числе и связанных с рибосомой ([321-324]), заставляет предположить, что эти РНК-расплетающие белки создают некий общий уровень неполного плавления структур РНК, участвующих в самых разных взаимодействиях.
eIF4B. Белок с ярко выраженной способностью связываться с одноцепочечной РНК [325]. elF4B не является консервативным белком и имеется только у эукариот, его последовательность достаточно сильно варьирует у разных видов [267, 326-329]. Молекулярная масса eIF4B млекопитающих - 69,3 кДа (см. обзоры в [23, 48]). eIF4B не является жизненно необходимым у дрожжей, но его отсутствие сильно влияет на эффективность трансляции мРНК с разными 5'-нетранслируемыми участками [327-328]. eIF4B представлен в цитоплазме клеток млекопитающих на среднем уровне: имеется около 0,4 молекул eIF4B на одну рибосому [164]. В растворе eIF4B существует в форме гомодимера [145, 326, 329-330]. Важнейшая функция eIF4B — взаимодействие с РНК-хеликазой eIF4A в составе инициаторного комплекса и стимулирование гидролиза АТФ белком eIF4A (обзоры в [23, 48, 272, 281].
eIF4B организован следующим образом: на N-конце находится участок, отвечающий за связывание РАВР, после него следует RRM-домен, связывающий* 18S рРНК 40S субъединицы рибосом, после которого следует DRYG-содержащий домен гомодимерпзации* eIF4B и аргинин-обогащенный домен на С-конце, участвующий, видимо, в связывании мРНК [330-332]. Известна структура RRM-содержащей части elF4B [331]. Эта часть eIF4B обеспечивает специфическое сродство непосредственно к рибосомпой РНК [330]. Помимо этого, RRM-мотив elF4B, видимо, связывается со вторым НЕАТ-доменом eIF4G по аналогии