Исследование регуляции оперона rpsB-tsf, кодирующего рибосомный белок S2 и фактор элонгации трансляции Ts

• Автор: Асеев, Леонид Викторович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 146 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ. Общая характеристика работы
1.1 Актуальность работы
1.2 Цели и задачи исследования
1.3 Научная новизна и практическая значимость работы
1.4 Апробация и публикация работы
ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1 Внерибосомные функции рибосомных белков
2.1.1 Введение
2.1.2 Внерибосомные функции рибосомных белков у прокариот
2.1.3 Внерибосомные функции рибосомных белков у эукариот
2.1.4 Заключение
2.2 Сведения об опероне тртВ-А/
2.2.1 Структура оперона гряВм/
2.2.2 Рибосомный белок Б2: структура, положение и контакты в составе рибосом
2.2.3 Консервативность белка 82 и его функциональная роль в клетке
2.2.4 Мутации по гену грБВ
2.2.5 Заключение
ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1 Материалы
3.1.1 Реактивы
3.1.2. Буферные и другие растворы
3.1.3 Ферменты и другие белки
3.1.4 Наборы реактивов
3.1.5 Маркеры длин нуклеиновых кислот и молекулярной массы белков..
3.1.6 Микробиологические среды
3.1.7 Антибиотики
3.1.8 Штаммы и плазмиды
3.1.9 Оборудование
3.1.10 Расходные материалы
3.1.11 Программное обеспечение и базы данных
3.1.12 Олигонуклеотиды
3.2 Методы
3.2.1 Очистка олигонуклеотидов в ПААГ

3.2.2 Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле
3.2.3 Получение плазмиды pS2, экспрессирующей белок S
3.2.4 Получение компетентных клеток
3.2.5 Трансформация
3.2.6 Получение штаммов, в которых трансляционный инициаторный район (ТИР) гена rpsB слит в рамке с хромосомным геном lacZ
3.2.7 Определение количества белка по методу Брэдфорд (Bradford)
3.2.8 Измерение /З-галактозидазы в клеточных экстрактах
3.2.9 Выделение тотальной РНК из клеток E.coli
3.2.10 Радиоактивное мечение праймера (кинироваение)
3.2.11 Картирование 5’ конца мРНК rpsB методом удлинения праймера
3.2.12 Секвенирование плазмидной ДНК по методу Сенгера
3.2.13 Выравнивание нуклеотидных последовательностей
3.2.14 Анализ вторичной структуры РНК in silico
3.2.15 Получение конструкций rpsB-lacZс делециями в 5’-НТО rpsB
3.2.16 Электрофорез белков в полиакриламидном геле по методу Лэммли
[Laemrali 1970]
3.2Л7 Идентификация белков методом Вестерн-блот-анализа
3.2.18 Нозерн-блот анализ
3.2.19 Получение Р1-фаголизатов в жидкой среде
3.2.20 Введение мутаций в хромосому Escherichia coli методом Р1-трансдукции
3.2.21 Иммунопреципитация белков на A/G-белок-агарозе
3.2.22 Сайт-направленный.мутагенез области промотора rpsB
3.2.23 Индукция строгого контроля при добавлении серингидроксамата
3.2.24 Обратная транскрипция (ОТ) с последующей полимеразной цепной реакцией (ПЦР)
ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
4.1 Введение
4.2 Рибосомный белок S2 является негативным регулятором собственного синтеза in vivo
4.2.1 Принцип экспериментального подхода к изучению регуляции оперона in vivo
4.2.2 Создание генетических конструкций для исследования регуляции оперона rpsB-tsf
4.2.3 Исследование аутогенной регуляции оперона rpsB-tsf в полученных штаммах
4.3 Локализация промотора оперона rpsB-tsf
4.4 Анализ консервативности 5’-нетранслируемой области (НТО) оперона rpsB-tsf
4.5 В регуляцию экспрессии гена rpsB вовлечена 5’-НТО тртВ-мРНК
4.6 Консервативность механизма аутогенной регуляции гена rpsB у гамма-протеобактерий
4.7 Анализ активности rpsB промоторов из Ypestis, H.influenzae и
P.aeruginosa при транскрипции в составе хромосомы E.coli
4.8 Анализ способности белка S2 Е. coli к регуляции экзогенных 5’-НТО in vivo
4.9 Делеционный анализ регуляторной области оперона rpsB-tsf Escherichia coli
4.10 Механизм регуляции синтеза EF-Ts
4.11 Влияние мутаций в опероне rpsB-tsf на синтез белков S2 и Ts в клетке.
4.12 Аутогенная регуляция rpsB-tsf возможно осуществляется комплексом белков S1 и S
4.13 Исследование свойств промотора оперона rpsB-tsf
4.13.1 Мутационный анализ
4.13.2 Изучение влияния аминокислотного голодания на активность PrpsB
ГЛАВА 5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

образования опухолей, так как дефектные белки не способны нормально выполнять свои рибосомные и внерибосомные функции (подробнее об участии рибосомных белков в образовании опухоли см. например Lai and Xu. 2007).
Другие внерибосомные функции р-белков.
Рибосомный белок L7 архей входит в состав CD мяРНК комплекса, вовлечённого в процессинг РНК. У эукариот есть подобный ему белок 15,5 с аналогичной функцией [Kuhn et al., 2002]. Этот белок - пример р-белка, который приобрел внерибосомную функцию и затем эволюционировал в нерибосомный белок.
Методом масспектрометрии показано, что RACK1 (рецептор активированной киназы С), белок необходимый для передачи сигналов в клетке, входит в состав рибосомы [Link et al., 1999]. По данным криоэлектронной микроскопии он располагается в районе головы малой рибосомной субъединицы вблизи канала для мРНК [Sengupta et al., 2004]. RACK1 связывается с активированной протеинкиназой С, что стимулирует трансляцию за счёт фосфорилирования инициаторного фактора 6 и, возможно, мРНК-ассоциированных белков. Также RACK1 образует комплекс с мембранными рецепторами, обеспечивая «докинг» рибосом и локализацию трансляции в определённых областях [Nilsson et al., 2004]. Таким образом, RACK1 является связующим звеном между аппаратом трансляции и клеточной сигнализацией, а также участвует в передаче сигналов отдельно от рибосом.
Рибосомный белок SO/ламининовый рецептор.
Р-белок S0 (у дрожжей) или Sa (у высших эукариот) является аналогом р-белка S2 прокариот. Имеются данные, что у дрожжей Saccharomyces cerevisiae [Ford et al., 1999; Tabb-Massey et al., 2003] и Schizosaccharomyces pombe [Sato et al., 2003] р-белок SO (совместно с рибосомным белком S21) участвует в созревании 40S рибосомной субъединицы. Белок S0 необходим для процессинга 208-предшественника рРНК в зрелую 18S рРНК и, возможно,