Структурные и кинетические исследования образования и распада комплексов рибосомного белка L1 с РНК

• Автор: Костарева, Ольга Сергеевна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 102 с. : ил.

Содержание
СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1.Введени е

1.2.Явленис поверхностного резонанса плазмонов

1.3.Lr-SPR, Sr-SPR -сенсоры

1.4.Лнганды и их иммобилизация на чипе

1.4.1.Иммобилизация за счет физической адсорбции

1.4.2.Бислойная иммобилизация

1.4.3.Ковалентная иммобилизация
1.4.4.Аффинная иммобилизация
1.4.5. ДНК-опосредованная иммобилизация
1.4.6.Иммобилизация малых молекул
1.5. Виды взаимодействий, которые используются при проведении экспериментов на биосенсорах
1.5.1 .Непосредственное взаимодействие
1.5.2. Многослойное (sandwich) взаимодействие
1.5.3.Взаимодействие с замещением (displacement)
1.5.4.Непрямое конкурентное ингибирование
1.6.Определение кинетических и равновесных констант, характеризующих взаимодействие молекул
1.6.1 .Измерение константы равновесия
1.6.2.Определение констант скоростей ассоциации и диссоциации
1.7. Применение ППР биосенсоров в различных областях

1.7.1. Исследование РНК-белковьтх взаимодействий
1.7.2. Исследование ДНК-ДНК взаимодействий
1.7.3. Изучение пеитид-мембранных взаимодействий
1.7.4. Изучение взаимодействий белок-рибосома
1.7.5. Медицинская диагностика
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2Л. Материалы
2.1.1. Химические реактивы и ферменты
2.1.2. Буферы
2.1.3 .Среды
2.1.4. Бактериальные штаммы и плазмиды
2.1.5. Принадлежности
2.1.6. Приборы
2.2.Методы
2.2.1.Методы генной инженерии и микробиологии
2.2.1.1. Полимеразная цепная реакция
2.2.1.2.Электрофорез ДНК в агарозном геле
2.2.1.3.Обработка ДИК сайт-специфическими эндонуклеазами
2.2.1.4. Очистка фрагментов ДНК
2.2.1.5. Лигирование ДНК
2.2.1.6. Получение компетентных клеток
2.2.1.7.Трансформация клеток Л. coli
2.2.1.8. Анализ клонов с помощью ПЦР
2.2.1.9. Выделение и очистка плазмидной ДНК
2.2.1.9.Проведение реакции секвенирования
2.2.1.10.Выделение и очистка больших количеств плазмидной ДНК
2.2.1.11 .Рестрикция плазмидной ДНК для транскрипции и ее последующая очистка

2.2.1.12. Экспрессия генов белков TthLl, MjaLl и их мутантных форм в штамме-суперпродуценте E. coli
2.2.2.Выделение и очистка белков

2.2.2.1. Выделение белков TthLl и IdTthLl из клеток штамма-суперпродуцента Е. coli

22.2.2.Катионообменная хроматография на смоле CM-Sepharose
2.2.2.3. Аффинная хроматография на смоле Heparin- Sepharose
2.2.2.4.Электрофорез белков в ПААГ в присутствии ДСН
2.2.2.5. Электрофорез белков в ПААГ в неденатурирующих условиях
2.2.2.6. Проверка отсутствия РНКазной активности в полученном препарате белка.
2.2.3.Выделение и очистка РНК
2.2.3.1. Получение специфических фрагментов мРНК
2.2.3.2. Электрофорез РНК в ПААГ в денатурирующих условиях
2.2.3.3.Электрофорез нуклеиновых кислот в ПААГ в неденатурирующих условиях.
2.2.4. Получение и кристаллизация мутантных форм белка L1 и РНК-белкового комплекса
2.2.5. Анализ РНК-белковых комплексов методом поверхностного плазмонного резонанса
2.2.5.1. Биотинилирование фрагмента РНК
2.2.5.2. Модификация поверхности чипа
2.2.5.3. Определение констант ассоциации и диссоциации методом поверхностного плазмонного резонанса
2.2.6. Проверка способности белка TthLl и его изолированного домена I регулировать синтез белка LI in vitro
2.2.6.1. Сопряженная транскрипция-трансляция in vitro
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Конструирование фрагмента рРНК
3.1.1.Клонирование гена специфического фрагмента рРНК
3.1.2. Получение фрагментов РНК в препаративных количествах
3.1.3. Электрофоретический анализ комплексов белка L1 с фрагментами РНК
3.1.4. Подготовка фрагментов РНК для кинетических экспериментов
3.2. Получение и характеристика изолированного домена I рибосомного белка L1 из Т. thermophilus
3.2.1. Выделение и очистка рибосомного белка L1 и домена I белка L1 из Г. thermophilus

для концентрации анализируемого вещества С. Лмакс - это максимальная величина сигнала, которая зависит от концентрации лиганда и молекулярного веса аналита. Равновесный сигнал Лрш, достигается, когда d/?(r)/dt =0. Таким образом, предыдущее уравнение можно переписать как
-^равн “ (1 / (&дис<Аасс + Q) С R макс (3)
Или, используя константу равновесия Ка= кдто/кЗС1:,
-^равн = CRMm( /(Кй +С)) (4)
что подобно изотерме Ленгмюра. Равновесная константа диссоциации К, рассчитывается из кривой зависимости равновесного сигнала в точке на плато от концентрации анализируемого вещества. Стандартный метод оценки Ка состоит в измерении равновесного сигала /{ра„„ для различных концентраций лиганда Су. Преобразовав предыдущее уравнение в линейную форму, получим:
( 1/Ск)Лрав„(Ск)= {-МКй )Лрш„(Ск) + (1 /Ка )Кткс (5)
Анализ Скэтчарда основан на определении сигнала связывании в равновесных условиях и соответствующих концентраций анализируемого вещества. Прямая 7?раш/Су, отложенная против Лравн, имеет наклон, равный -1/Ка, и пересекает ось х в точке RmKJKd (пример графика приведен на рисунке 16. Надо отметить, что последнее уравнение позволяет рассчитать Кл и Дмакс из значений равновесных сигналов при различных концентрациях, не достигая насыщения лигандов поверхности анализируемым веществом. На самом деле, при низкой аффинности взаимодействий, когда Ка лежит в микромолярном диапазоне - (0.1-500 мМ), насыщение поверхности сенсора достигается очень редко.
1.6.2.Определение констант скоростей ассоциации и диссог^ации
Когда концентрация анализируемого вещества в проточной ячейке падает до нуля, то связавшиеся молекулы не находят замены и сигнал начинает возвращаться к своему начальному значению со скоростью, определяемой силой связывания (Рис. 16). Скорость диссоциации ктсс можно вывести, исходя из характера уменьшения сигнала R со временем t:
R(t) = Я(г0) exp [~kàucc(t - г0)] (6)
Время to указывает на момент начала падения сигнала, когда большее число молекул покидает лиганд, чем связывается с ним.