РНК-полимераза E. coli: экспресс-метод выделения высокочистых препаратов; новые возможности структурно-функциональных исследований

• Автор: Ходак, Юлия Александровна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 114 с. : ил.

Содержание.
Содержание

Список сокращений и терминов, использованных в работе

Введение

Обзор литературы

Методы выделения многосубъединичных белков

I. Получение многосубъединичных белков из природных источников

1.1 Хроматографические методы

1.2 Электрофоретические методы

1.2.1 Нативный электрофорез с использованием голубого красителя (BNE)

1.2.2 Бесцветный нативный электрофорез (CNE)

1.2.3 Бесцветный нативный электрофорез высокого разрешения (hrCNE)
II. Гетерологичная экспрессия многосубъединичных белков
II. 1 Реконструкция многосубъединичных комплексов in vitro из отдельно выделенных компонентов
11.2 Экспрессия под контролем природных промоторов с использованием модулей для аффинной очистки
11.3.1 Прокариотические системы для гетерологичной экспрессии многосубъединичных белков
11.3.1.1 Множественные векторы
П.3.1.2 Один вектор, один РНК-транскрипт
11.3.1.3 Один вектор, множественные РНК-транскрипты
11.3.2 Эукариотические системы для гетерологичной экспрессии
многосубъединичных белков
11.3.2.1 Методы, основанные на выявлении трансформантов, обладающих известным уровнем экспрессии гетерологичных продуктов
11.3.2.1.1 Использование IRES-содержащих ретровирусных векторов
П.3.2.1.2 Метод последовательного слияния трансформантов
11.3.2.2 Методы, основанные на ослаблении эффекта положения
11.3.2.2.1 Мультицистронные векторы с системой положительной обратной связи
11.3.2.2.2 Амплификация генного локуса
11.3.2.2.3 Дрожжевые векторы
11.3.2.2.4 Эписомальные векторы

11.3.2.2.5 Бакуловирусные векторы
11.3.2.2.6 Челночные векторы
II.4 Использование бесклеточных систем белкового синтеза для получения многосубъединичных комплексов
III. Аффинная очистка многосубъединичных белков
III. 1 Иммуноаффинные методы
111.2 Тандемная аффинная очистка
111.3 Аффинная очистка биотинилированных белков
111.4 Использование системы «IMPACT» для аффинного выделения многосубъединичных белков
IV. Выделение ДНК-зависимой РНК-полимеразы E. coli
Материалы и методы
Результаты исследования и их обсуждение
1. Конструирование векторов для экспрессии субъединиц холофермента РНКП
2. Особенности экспрессии субъединиц РНКП E. coli слитых с техническим модулем интеин-CBD
3. Исследование свойств полученных препаратов РИКИ E. coli
4. Получение препарата кор-фермента с использованием индуцируемой низкомолекулярными лигандами диссоциации холофермента
4.1 Получение чистых препаратов РНКП: использование способствующих диссоциации холофермента низкомолекулярных веществ
4.2 Структура и свойства межбелковых контактов
4.3 Влияние свободных аминокислот на процесс инициации транскрипции
4.4 Структура области контактов кор-фсрмента и о-субъединицы РНКП E.coli.lG
4.5 Влияние коротких пептидов на процесс инициации транскрипции
4.6 Получение чистого препарата кор-фермента РНКП
4.7 Новый способ получения чистого препарата холофермента РНКП
5. Применение полученых препаратов РНКП E. coli и её компонентов для структурно-функциональных исследований
Выводы
Список литературы

Список сокращений и терминов, использованных в работе.
В работе использованы обозначения аминокислотных остатков (однобуквенные и трёхбуквенные) и рибонуклеозидтрифосфатов в соответствии с номенклатурой Международного союза чистой и прикладной химии (KJPAC) и Международного союза биохимиков (IUB), а также следующие сокращения:
BNE Blue Native Electrophoresis нативный электрофорез с использованием
голубого красителя
CNE Colorless Native Electrophoresis бесцветный нативный электрофорез
hrCNE high resolution CNE бесцветный нативный электрофорез высокого разрешения
DEAE Diethylaminoethyl cellulose диэтиламиноэтил целлюлоза
DDM n-Dodecyl P-D-maltoside додецилмальтозид
EDTA ethylenediamine-N,N,NN’- tetraacetate этилендиаминтетрауксусная кислота
EGT A , ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid 2-аминоэтилтетрауксусная кислота
HPLC High Performance Liquid высокоэффективная жидкостная
Chromatography хроматография
IPTG Isopropyl-thio-p-D-galactosi.de изопропилтио-р-В-галактопиранозид
IRES Internal Ribosome Binding Site внутренний сайт связывания рибосом
LTR Long Terminal Repeat длинный концевой повтор
MCS Multiple Cloning Site сайт для множественного клонирования
TAP Tandem Affinity Purification тандемная аффинная очистка
Polymin P полиэтиленимин
a o. аминокислотные остатки
БСА бычий сывороточный альбумин
КФ ДНК1Т фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I E. coli
П.Н. пары нуклеотидов
ПЦР полимеразная цепная реакция
РНКП ДНК-зависимая РНК-полимераза

соотношением уровней экспрессии рекомбинантных субъединиц. Например, за эффективностью коэкспрессии двух генов можно следить, «пометив» их эпитопами [131-133]. Иммуноаффинный метод на основе FLAG-пептида был использован для масштабного исследования белковых комплексов дрожжей [134]. Подобный принцип также был реализован в клетках млекопитающих, где для встраивания последовательности аффинного CD-модуля в гены клетки-хозяина применяли ретровирусные векторы [135].
Ш.2 Тандемная шЬ(Ьипния очистка.
Одним из наиболее часто используемых методов для изучения белковых комплексов в настоящее время является «тандемная аффинная очистка» (Tandem Affinity Purification, ТАР).
Впервые этот метод был предложен в качестве универсального способа идентификации белков гаплоидных клеток дрожжей, входящих в многосубъединичные комплексы с неизвестным составом [59]. Модули для аффинной очистки подбирали таким образом, чтобы они не влияли на активность целевого комплекса и, кроме того, позволяли эффективно извлекать присутствующие в низкой концентрации целевые белки из сложной смеси веществ, образующейся при разрушении клеток. Использовали модуль, состоящий из кальмодулин-связывающего пептида (СВР) и IgG-связывающего домена белка А Staphylococcus aureus (ProtA). СВР обладает высокой селективностью и позволяет снимать целевой белок с носителя в мягких условиях. При использовании домена ProtA иммобилизованный на носителе белок, напротив, можно снять только в денатурирующих условиях при низких значениях pH. Чтобы избежать стадии денатурации, между доменами помещали сайг узнавания протеазы TEV (tobacco etch virus). Данная протеаза обладает очень высокой селективностью и практически никогда не расщепляет целевой белок. Кассета, кодирующая СВР, сайт расщепления TEV и ProtA получила название TAP-модуля. Её встраивали в геном гаплоидной дрожжевой клетки в одной рамке считывания с целевым белком (более подробно этот процесс описан в глане П.2). Таким образом, экспрессию контролировал природный промотор, обеспечивающий обычный для клетки уровнень синтеза белка. Клеточный лизат, содержащий целевой комплекс, пропускали через колонку с иммобилизованными IgG и после промывки обрабатывали TEV-протеазой. Следующая аффинная очистка с использованием СВР позволяла избавиться от присутствия протеазы. Было показано, что такая двухстадийная очистка приводила к получению более чистых и качественных препаратов, чем использование каждого модуля по отдельности.