Структурно-функциональный анализ моноклональных антител, кроссреактивных к вирусным антигенам, при рассеянном склерозе

• Автор: Ломакин, Яков Анатольевич
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 119 с. : ил.

Оглавление
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Рассеянный склероз
1.1 Роль Т-клеток в развитии и патологии рассеянного склероза
1.2 Роль В-клеток в развитии и патологии рассеянного склероза
1.3 Структурные особенности CDR и проблема кроссреактивности антител
1.4 Этиология рассеянного склероза
1.5 Вирусное влияние на развитие Рассеянного Склероза (Инфекционные факторы окружающей среды)
1.5.1 Вирус Эпштейн-Барр
1.5.2 Человеческий вирус герпеса
1.5.3 Вирус ветряной оспы
1.5.4 Вирус Торке Тено
1.5.5 Цитомегаловирус
1.5.6 Вирус простого герпеса
1.5.7 Человеческий эндогенный ретровирус (HERV)
2. Комбинаторные библиотеки
2.1 Комбинаторные фаговые библиотеки антител человека
2.2 Конструирование иммунных библиотек
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
1. Проверка функциональности фаг-дисплейной библиотеки репертуара одноцепочечных антител больных рассеянным склерозом
2. Скрининг библиотеки на ОБМ и получение моноклональных одноцепочечных антител, связывающих ОБМ
3. Анализ полученных одноцепочечных антител, связывающих ОБМ
ЗЛ Анализ одноцепочечных анти-ОБМ антител, экспонированных на бактериофаге
3.2 Анализ одноцепочечных антител в индивидуальном виде
3.3 Определение гомологии зародышевых линий
4. Получение полноразмерных человеческих антител на основе одноцепочечных антител, связывающих ОБМ
4.1 Доказательство in vitro кроссреактивности между аутоантигеном ОБМ и белком вируса Эпштейна-Барр LMP
5. Рациональный анализ комбинаций тяжелых и легких цепей анти-ОБМ антител, полученных комбинаторным подходом
5.1 Изучение изменения уровня кроссреактивности в зависимости от комбинации цепей с использованием технологии Luminex
5.2 Изучения изменения аффиности к антигену (ОБМ) путем измерения констант диссоциации с использованием метода поверхностного плазмонного резонанса
6. Биоинформатический анализ аутореактивных IgG
7. Широкомасштабное секвенирование
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Работа с нуклеиновыми кислотами
Амплификация фрагментов ДНК методом полимеразной цепной реакции
Рестрикция
Лигирование
Выделение плазмидной ДНК

Электрофорез ДНК в агарозном геле
Электрофорез ДНК в полиакриламидном геле
Электроэлюция
Секвенирование плазмидной ДНК
Широкомасштабное секвенирование генов вариабельных участков Vh/Vl из фаг-дисплейных библиотек
Параметры фильтров для анализа встречаемости гипервариабельных участков
Создание генетических конструкций для экспрессии рекомбинантных одноцепочечных антител
Создание генетических конструкций для экспрессии рекомбинантных полноразмерных антител
РАБОТА С БЕЛКАМИ
Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле
Окрашивание ПААГ
Иммуноблоттинг
Иммуноферментный анализ
ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ ПРОЦЕДУРЫ
Выделение и очистка рекомбинантных антител
Очистка рекомбинантных одноцепочечных антител (scFv)
Выделение и очистка рекомбинантных фыожн-белков trx-обм пептидов
Обращенно-фазовая хроматография
Молекулярное моделирование
Метод поверхностного плазмонного резонанса
Анализ кроссреактивности антител с использованием технологии Luminex
МЕТОДЫ РАБОТЫ С БАКТЕРИЯМИ ESCHERICHIA COLL
Получение электрокомпетентных клеток
Трансформация клеток E.coli методом электропорации
ПЦР с колоний
Ночная культура
Приготовление музейного штамма
Экспрессия рекомбинантных белков МОГ, пептидов ОБМ в клетках Е. Сой
РАБОТА С ФАГАМИ
Амплификация библиотеки
Обогащение библиотеки фаговыми антителами
МЕТОДЫ РАБОТЫ С ЭУКАРИОТИЧЕСКИМИ КЛЕТКАМИ
Ведение культуры эукариотических клеток линии СНО и НЕК-
Приготовление музея эукариотических клеток
Выведение линии эукариотических клеток из заморозки
Трансфицирование эукариотических клеток методом липофекции
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Ат - антитело
АПК - антигенпредставляющая клетка ВЭБ - вирус Эпштейн-Барр
ГКГС (МНС) - главный комплекс гистосовместимости
ГЭБ - гематоэнцефалический барьер
ГЦ - герминативный центр
ДМСО - диметилсульфоксид
ДНК - дезокси-рибонуклеиновая кислота
ДСН - додецилсульфат натрия
ЭАЭ - экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит
ИЛ - интерлейкин
ИМ - инфекционный мононуклеоз
ИФА - иммунно-ферментный анализ
ИФНб - интерферон-бета
кДа - килодальтон
МОГ - миелин-олигодендроцитарный гликопротеин
ОБМ - основный белок миелина
ПААГ - полиакриламидный гель
ПДРФ - полиморфизм длин рестриктовых фрагментов
ПК - плазматическая клетка
ПЛП - протеолипидный протеин
ППР - поверхностно-плазмонный резонанс
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ЦНС - центральная нервная система
ЦСЖ - цереброспинальная жидкость
ФСБ - фосфатно-солевой буфер
PC - рассеянный склероз
CDR - англ. complementarity determining region
EBNA-1 - англ. Epstein Barr nuclear antigen
IgG - иммуноглобулины класса G
IPTG - изопропил-р-БП-тиогалактопиранозид
LMP1- англ. latent membrane protein
scFv - одноцепочечное антитело {англ. single chain fragment variable) Th - Т-хелперы
Tr, Treg - Т-регуляторные клетки

энцефалита Тейлера (модель для PC), увеличив моторику, и частично уменьшив атрофию мозга. Аналогично MCMV обладал иммуномодуляторными эффектами, уменьшая количество CD3+/CD4+ клеток в мозге [166]. На примере цитомегаловируса была показана и молекулярная мимикрия между вирусным пептидом и МОГ, но ЭАЭ при этом индуцировать им не удалось [167].
1.5.6 Вирус простого герпеса
Вирус простого герпеса - представитель ДНК-вирусов подсемейства Alpha-herpesvirinae Herpesviridae размером 110-120 нм. Он амплифицируется в ядрах и цитоплазме инфицированных клеток. Инфекция обычно имеет место в течение первых лет жизни, проходя в латентной форме и без симптомов, единственным следствием которой остается наличие вируса в ганглии тройничного нерва на протяжении всей жизни носителя [168]. Известно, что вирус может мигрировать от периферических ганглиев в височные доли головного мозга, вызывая энцефалиты [169]. 70-80% пациентов с PC имеют повышенный титр антител к HSV типа I. Были предприняты попытки обнаружить антитела к HSV и в ЦСЖ, но полученные различия были малодостоверными — 2.1% у больных PC против полного отсутствия у здоровых [170]. Работа американских патологоанатомов, проведенная на тканях мозга больных PC, подтвердила наличие вируса в очагах демиелинизации в 37% случаев, в 32% случаев в демиелинизирующих бляшках было подтверждено наличие другого типа вируса простого герпеса человека - 6А [170-172]. Данный вирус, в свою очередь, относится к подсемейству Betaherpesvirinaevirus с размерами 160-210 нм, и так же считается одним из ко-фактором в развитии PC, особенно в процессе ремиссии.
1.5.7 Человеческий эндогенный ретровирус (HERV)
Семейства эндогенных ретровирусов присутствуют в человеческой ДНК, очевидно попав в зародышевые линии клеток большинства