Анализ структурно-функциональных особенностей РНК-полимеразы термофильной бактерии Thermus Aquaticus

• Автор: Миропольская, Наталия Александровна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 138 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Основные механизмы инициации и элонгации транскрипции бактериальной РНКП

1. Механизм инициации транскрипции

2. Механизм синтеза РНК на стадии элонгации транскрипции

2.1. Структура элоигационного комплекса

2.2. Реакции, катализируемые РНКП

2.3. Механизм присоединения NTP в активном центре РНКП

2.4. Механизм транслокации РНКП

3. Действие антибиотиков на каталитический цикл РНКП
3.1. Стрептолидигин
3.2. а-Аманитин
4. Заключение
II. ОСОБЕННОСТИ БЕЛКОВ ТЕРМОФИЛЬНЫХ ОРГАНИЗМОВ
5. Стабильность и конформационная подвижность белков термофилов
5.1. Стабильность белков термофилов
5.2. Связь между конформационной подвижностью и каталитической активностью
6. Структурные особенности белков термофилов
6.1. Анализ аминокислотного состава белков термофилов
6.2. Уменьшение количества незаряженных полярных аминокислот в белках термофилов
6.3. Увеличение количества заряженных аминокислотных остатков в белках термофилов
6.4. Увеличение числа гидрофобных остатков в белках термофилов
6.5. Увеличение среднего размера аминокислотного остатка и плотности упаковки в белках термофилов
6.6. Изменения свойств поверхности белков термофилов
6.7. Различия во вторичной структуре белков термофилов и мезофшов
6.8. Увеличение количества субъединиц у белков термофилов
7. Исследование термостабильности белков путем направленного мутагенеза
7.1. Влияние точечных аминокислотных замен на термостабильность
7.2. Направленная эволюция с использованием случайного мутагенеза
7.3. Исследование химерных белков
8. Заключение
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Бактериальные штаммы, плазмиды
2. CTAI1ДАРТНЫЕ методы работы с ДНК
3. Получение промоторных фрагментов ДНК
3.1. Получение матриц для транскрипции
3.2. Получение радиоактивно-меченых промоторных фрагментов
4. Получише радиоактивно-меченых олигонуклеотидов
5. Конструирование мутаций в субъединицах РНКП
5.1. (3-субъединицы РНКП Т. aquaticus и D. radiodurans
5.1.1. р'-субъединица РНКП D. radiodurans и мозаичная Р'-субъединица TTD
5.1.2. Мозаичные Р'-субъединицы F-Dra и jaw

5.1.3. ß'-субъединицы РНКП Т. aquations с одной или несколькими точечными мутациями,
и с делецией F-петли
5.2. ст-субъединицы E. coli и Т. aquations
6. Электрофорез белков в денатурирующем геле
7. Выделение о-субъединицы РНКП
8. Выделение кор-фермента РНКП
9. Получение аптамеров к о-субъединице РНКП
10. Транскрипция in vitro
11. Эксперименты с минимальной матрицей
12. Футприптинг перманганатом калия
13. Эксперименты по замедлению в геле фрагментов ДНК
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Особенности инициации транскрипции РНКП Т. aquaticus
1.1. Функции промопюрного элемента GGGA в узнавании природных промоторов Т. aquaticus и Т. thermophilus
1.2. Узнавание промотои юго элем hi it a GGGA о-субъединицей и холоферментом РНКП Е
1.3. Структурные элементы РНКП, необходимые для инициации транскрипции на GGGA-содержащих промоторах
1.4. Роль GGGA-элемента в плавлении промоторов и с табилизации пгомоторпых комплексов
1.4.1. Роль GGGA-элемента в плавлении промоторов
1.4.2 Роль GGGA-элемента в стабилизации промоторпых комплексов
2. Анализ особенностей катализа в активном центре РНКП Т. aquaticus
2.1 Различия в скорости синтеза РНК у РНКП мезофгтытх и термофильных бактерий
2.2 Структурные элементы РНКП, определяющие скорость синтеза РНК
2.2.1 Элонгационые свойства различных вариантов РНКП Т. aquaticus
2.2.2. Замены в F-петле и F-спирали влияют на скорость присоединения нуклеотидов
2.2.3 Влияние стрептолидигина на присоединение нуклеотидов различными вариантами РНКП Т. aquaticus
2.2.4 Влияние мутаций в F-петле на дискриминацию субстратов РНКП
2.2.5 Роль F-петли в расщеплении РНК
2.2.6 Функции F-петли в транскрипции у РНКП разных организмов
ВЫВОДЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ
ПРИЛОЖЕНИЕ
ПРИЛОЖЕНИЕ
ПРИЛОЖЕНИЕ
ПРИЛОЖЕНИЕ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
BSA - бычий сывороточный альбумин DTT- дитиотреитол
dNTP - дезоксирибонуклеозидтрифосфат
EDTA - этилендиаминтетраацетат
IPTG - изопропил-Р-тио-О-галактопираиозид
NTP - рибонуклеозидтрифосфат
PMSF — фснилметилсульфонилфторид
SDS - додецилсульфат натрия
SELEX - systematic evolution of ligands by exponential enrichment
Stl - стрептолидигин
Tm - температура денатурации
Topt — оптимальная температура роста
а.к. - аминокислотный остаток
дцДНК - двухцепочечная ДНК
ММ - минимальная матрица
НК - нуклеиновые кислоты
нт - нуклеотидов
оцДНК - одноцепочечная ДНК
п.н. — пар нуклеотидов
ПААГ - полиакриламидный гель
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РНКП - РНК-полимераза
ЭК - элонгационный комплекс

6.1. Анализ аминокислотного состава белков термофилов
В последнее десятилетие было проведено несколько крупных исследований, направленных на сравнение аминокислотного состава белков мезофилов и термофилов. Для того, чтобы при проведении подобных исследований выявить отличия, связанные именно с температурной адаптацией, необходимо учитывать три критерия: (i) должна быть использована достаточно большая выборка самых разнообразных белков, (и) для сравнения желательно использовать белки с высоко гомологичной последовательностью, и (iii) GC-состав ДНК исследуемых организмов должен быть очень похожим (Haney et al., 1999а).
Исходя из этих критериев, Haney и соавторы выбрали для сравнения белки представителей рода Methanococcus (Haney et al., 1999a). Оптимальная температура для роста термофильной М. jannaschii составляет 85°С, что приблизительно на 50°С выше, чем для мезофильных М. voltae, М. vanniellii и М. maripaludis. Был проведен сравнительный анализ последовательностей 115 белков этих
Табл. 6.1. Изменение
архебактерий. Были показаны значительные аминокислотного состава в белках
изменения аминокислотного состава у белков термофилов по сравнению с
белками мезофилов по данным термофильного вида М. jannaschii по сравнению с (Haney et al., 1999а).
их ортологами из мезофильных видов
Methanococcus (см. Табл. 6.1): в белках термофила
по сравнению с белками мезофилов повышается
содержание изолейцина, аргинина, глутаминовой
кислоты, лизина, пролина и триптофана, тогда как
количество ссрина, треонина, метионина,
аспарагина и глутамина уменьшается. Такое
изменение аминокислотного состава (уменьшение
числа полярных незаряженных аминокислот в
пользу заряженных и гидрофобных) может
стабилизировать молекулу белка за счет
возникновения новых гидрофобных и ионных
взаимодействий (см. ниже).
аминокислота изменения, %