Идентификация и картирование регуляторных элементов в локусе FXYD5-COX7A1 хромосомы 19 человека

• Автор: Дидыч, Дмитрий Александрович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 120 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 2. ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

ГЛАВА 3. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

3.1 ЭУКАРИОТИЧЕСКИЕ ЭНХАНСЕРЫ И МЕТОДЫ ИХ

ИДЕНТИФИКАЦИИ

ЗЛ.1 Общая характеристика и свойства энхансеров

Структура энхансеров

Особенности структуры хроматина энхансеров

Локализация энхансеров в геноме

Механизмы действия энхансеров
Модель выпетливания (Looping model)
Модель отслеживания (Тracking model)
Модель распространяющегося выпетливания (Spreading/looping model)
Роль энхансеров в формировании преинициаторного транскрипционного
комплекса (ПИК)
Специфичность энхансеров
Роль энхансеров в развитии болезней
ЗЛ.2 Методы идентификации энхансеров
Экспериментальные подходы
Картирование участков гиперчувствительности ДНК кДНК-азе I
Методы на основе хроматин-иммунопреципитации (ChIP)
Картирование энхансеров с помощью метода фиксации конформации
хромосом (ЗС)
Биоинформатические подходы
Идентификация энхансеров с помощью методов сравнительной геномики. 30 Идентификация энхансеров in silico
3.2 ЭНХАНСЕРБЛОКИРУЮЩИЕ ЭЛЕМЕНТЫ (ИНСУЛЯТОРЫ)
3.2Л Общая характеристика и свойства инсуляторов
3.2.2 Механизмы действия энхансерблокирующих элементов
Образование петлевых доменов (looping model)
Нарушение «tracking»-Mexauu3Ma действия энхансера
3.2.3 Регуляция активности инсуляторов
3.3 CTCF - МНОГОФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ РЕГУЛЯТОР
3.3.1 CTCF и функционирование генома
CTCF и пограничные элементы генома
Распределение сайтов связывания CTCF в геноме
CTCF и повторяющиеся элементы генома
CTCF и когезиновый комплекс
3.3.2 Модели функционирования CTCF
Транскрипционное инсулирование
«Заякоривание» регуляторных комплексов

Образование функциональных независимых доменов хроматина
ГЛАВА 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
4.1 МАТЕРИАЛЫ
4.2 МЕТОДЫ
4.2.1 Стандартные методики
4.2.2 ПЦР-амплификация фрагментов ДНК
ПЦР-амплификация фрагментов библиотеки
ПЦР-скрининг колоний E. coli, содержащих плазмидную ДНК со
вставками
Радиоактивное мечение фрагментов ДНК с помощью ПЦР
4.2.3 Использованные культуры клеток
4.2.4 Трансфекция клеток с использованием реагента Lipofectamine 2000
4.2.5 Трансфекция клеток электропорацией
4.2.6 Получение вирусных частиц и инфицирование клеток
4.2.7 Определение титра вирусных частиц
4.2.8 Получение библиотеки фрагментов ДНК локуса FXYD5-COX7A хромосомы 19 человека
4.2.9 Радиоактивное мечение праймеров
4.2.10 Очистка меченой ДНК
4.2.11 Связывание меченых фрагментов ДНК с белками in vitro
4.2.12 Метод сдвига электрофоретической подвижности в полиакриламидном геле (EMSA - Electrophoretic Mobility Shift Assay)
4.2.13 Определение активности люциферазы
4.2.14 Селекция предполагаемых энхансеров
4.2.15 Фиксация и окрашивание клеток с помощью Coomasie Blue
4.2.16 Позитивно-негативная селекция инсуляторных последовательностей
4.2.17 Клонирование библиотеки и трансформация клеток E. coli
4.2.18 Приготовление компетентных клеток E.coli и их трансформация65
4.2.19 Подготовка плазмид для секвенирования
4.2.20 Картирование последовательностей
ГЛАВА 5. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
5.1 ИДЕНТИФИКАЦИЯ И КАРТИРОВАНИЕ ЭНХАНСЕР-ПОДОБНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ В ЛОКУСЕ FXYD5-COX7A1 ХРОМОСОМЫ 19 ЧЕЛОВЕКА
5.1.1 Получение ретровирусных конструкций, предназначенных для поиска энхансеров
5.1.2 Подготовка и клонирование библиотеки геномных фрагментов в ретровирусный вектор pQCXIX-Enh
5.1.3 Отбор последовательностей ДНК, обладающих энхансерной активностью
5.1.4 Клонирование потенциальных энхансеров и анализ выросших клонов E.coli
5.1.5 Секвенирование библиотеки потенциальных энхансеров
5.1.6 Проверка способности обнаруженных последовательностей связывать ядерные белки с помощью ЕМЬА
5.1.7 Проверка энхансерной активности обнаруженных фрагментов в системе двойной люциферазной детекции
5.1.8 Анализ расположения потенциальных энхансеров в геноме
5.2 ИДЕНТИФИКАЦИЯ И КАРТИРОВАНИЕ ДЕСЯТИ НОВЫХ ИНСУЛЯТОРОВ В ЛОКУСЕ ЕХУЕ>5-СОХ7А1 ХРОМОСОМЫ 19 ЧЕЛОВЕКА
5.2.1 Стратегия отбора потенциальных инсуляторов
5.2.2 Получение библиотеки фрагментов, предназначенной для селекции инсуляторов
5.2.3 Отбор предполагаемых инсуляторов
5.2.4 Анализ расположения инсуляторов в геноме
5.3 ЭНХАНСЕР-БЛОКИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ СТСЕ-СВЯЗЫВАЮЩИХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, КАРТИРОВАННЫХ В ЛОКУСЕ ЕХУЕ)5-СОХ7А1 ХРОМОСОМЫ 19 ЧЕЛОВЕКА
5.3.1 Конструирование плазмид
5.3.2 Инсуляторная активность СТСЕ-связывающих фрагментов
ГЛАВА 6. ВЫВОДЫ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

сходных условиях гены, а вместе с генами, промоторами и энхансерами образуют многоуровневую сеть регуляции транскрипционной активности.
3.2.2 Механизмы действия энхансерблокирующих элементов.
Предложено несколько механизмов, с помощью которых обеспечивается инсулирование энхансеров энхансерблокирующими элементами. По всей видимости, это определяется различными механизмами, посредством которых энхансеры оказывают активирующие действие на промоторы генов (Bondarenko et al., 2003). Было предложено несколько основных моделей описывающих действие различных инсуляторов (West et al, 2002).
Образование петлевых доменов (looping model)
Показано, что инсуляторы не инактивируют ни энхансеры, ни промоторы, а лишь, нарушают их взаимодействие друг с другом (Cai and Levine, 1995, Scott and Geyer, 1995). Эти данные свидетельствуют о роли инсуляторов в формировании пространственно-обособленных структур хроматина. Так, инсуляторы взаимодействуя друг с другом, образуют выпетливания промежуточных участков хромосом, что может приводить к разобщению энхансера и промотора (Рис. 7-А, стр. 36).
Ярким и хорошо изученным примером, подтверждающим эту модель, является функционирование gypsy ретротранспозона Drosophila, проявляющего инсуляторную активность (Geyer et al., 1986). Последовательность gypsy содержит 12 сайтов связывания белка SUHW, образующего комплекс с двумя другими белками СР190 и MOD(MDG4) (Pai et al., 2004). Этот комплекс посредством дополнительных белков взаимодействует с белками ядерной ламины (Capelson and Corces, 2005). В итоге, несколько gypsy-элементов, расположенные в разных участках хромосомы сближаются, образуя кластеры (инсуляторные тельца), располагающиеся на периферии ядра (Gerasimova et al., 2000). Периферическое расположение инсуляторных телец не является