Особенности генетической системы, контролирующей термальную адаптацию, у ряда видов отряда Diptera

• Автор: Юшенова, Ирина Александровна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 128 с. : ил.

Оглавление
Список сокращений
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Общая характеристика ответа на тепловой шок на молекулярном уровне
1.2. Классификация и функции белков теплового шока
1.3. Структура и эволюция генов теплового шока
1.4. Регуляция экспрессии генов теплового шока
1.5. Роль системы генов теплового шока в адаптации к условиям внешней среды и эволюции организмов
1.6. Молекулярные механизмы защиты от термального стресса,
не связанные с шаперонами
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Материалы
2.1.1. Виды Diptera
2.1.2. Штаммы E. coli
2.1.3. Ферменты рестрикции
2.1.4. Олигонуклеотиды для анализа связывания факторов
транскрипции с элементами теплового шока
2.1.5. Антитела
2.2. Методы
2.2.1. Условия теплового шока
2.2.2. Определение термоустойчивости
2.2.3. Включение in vivo 358-метионина в белки
2.2.4. Двумерный электрофорез белков по О’Фарреллу
2.2.5. Диск-электрофорез белков с ДДС-Na (по Лэммли)
2.2.6. Окрашивание гелей Кумасси G-
2.2.7. Иммуноблоттинг
2.2.8. Идентификация белков методом пептидного фингерпринтинга
2.2.9. Выделение тотальной РНК
2.2.10. Электрофорез РНК
2.2.11. Нозерн-гибридизация
2.2.12. Включение радиоактивной метки в ДНК
2.2.13. Анализ связывания факторов транскрипции с элементами
теплового шока
2.2.14. Создание и скрининг кДНК библиотек
2.2.15. 5'- и З'-ЯАСЕ анализ
2.2.16. Выделение геномной ДНК методом Ноїтсз-Воппсг
2.2.17. Выделение геномной ДНК
2.2.18. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции
2.2.19. Электрофорез ДНК
2.2.20. Перенос и гибридизация по Саузерну
2.2.21. Получение геномных фаговых библиотек
2.2.22. Скрининг геномных фаговых библиотек
2.2.23. Выделение ДНК бактериофага X
2.2.24. Построение рестриктных карт рекомбинантных фагов
2.2.25. Выделение фрагментов ДНК
2.2.26. Клонирование фрагментов ДНК
2.2.27. Трансформация компетентных клеток
2.2.28. Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса
2.2.29. ПЦР-анализ
2.2.30. Секвенирование ДНК
2.2.31. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей
2.2.32. Статистическая обработка результатов
Глава 3. Результаты исследования
3.1. Определение термоустойчивости
3.2. Накопление белков группы БТШ70 при тепловом шоке
3.3. Изучение спектра белков, синтезируемых после теплового шока
3.4. Изучение спектра изоформ БТШ70 и БТШ83 методом двумерного электрофореза
3.5. Идентификация белков 8б"аботу1с1ае методом пептидного фингерпринтинга
3.6. Определение кинетики индукции мРИК Изр70 и Изр
3.7. Исследование ДНК-связывающей активности ИБР у БНабопптбае
3.8. Анализ библиотек кДНК
3.9. Анализ генов Ъяр83 методом ПЦР
3.10. Саузерн анализ генов Ьзр70 8. ят^1агюг и О. рагёаИпа
3.11. Определение структуры кластера генов Ьяр70 у б1, ят^агюг и
О. рагйа1та
3.12. Анализ нуклеотидных последовательностей регуляторных областей
генов /ир70 у 51. «и^и/лг/ог и О. рагс1аИпа
3.13. Анализ нуклеотидных последовательностей и филогенетические отношения генов Ъ$р70 8, ып£и1агюг и О. раМаИпа
Глава 4. Обсуждение результатов
Выводы
Список литературы
Приложение
Благодарности

С другой стороны, важную роль в определении активности HSF играет негативная регуляция по типу отрицательной обратной связи другими шаперонами — БТШ90, БТ1П70, Hdjl/BTIII40 (Abravaya et al., 1992; Shi et al., 1998). Так было показано, что БТШ70 репрессирует трансактивационную активность HSF, непосредственно взаимодействуя с трансактивационным доменом HSF (Shi et al., 1998). БТШ90 участвует в поддержании мономерной конфигурации HSF в нестрессовых условиях и (совместно с БТШ70) в инактивации HSF-связывающей активности фактора, а также в распаде его тримсров после стресса (Ali et al.,1998; Zou et al., 1998; Morimoto, 1998; Shi et al., 1998; Marchler, Wu, 2001).
После TUI шапероны начинают взаимодействовать с денатурированными белками, HSF высвобождается из комплекса с БТШ90 и активируется для связывания de novo с HSE последовательностью. Индукция транскрипции БТШ денатурированными белками продемонстрирована микроинъекцией последних в ооциты шпорцевой лягушки (Ananthan et al., 1986). Когда синтезируется достаточное количество БТШ для восстановления поврежденных повышенной температурой белков, начинается взаимодействие свободных шаперонов с тримсрами HSF. HSF переходит в мономерную (неактивную) форму, и транскрипция генов ТШ завершается (Shi et al., 1998). При ингибировании функции БТШ90 во время стресса синтез БТШ продолжается значительно дольше, при этом HSF остается в акивированном состоянии (Duncan et al., 2005).
Транскрипционным регулятором генов ТШ также является белок менин (Papaconstantinou et al., 2005). На модельной системе дрозофилы показано, что менин является стресс индуцибельньш фактором, который при ТШ связывается с промотором генов TIU. Инактивация менина приводит к снижению индукции РНК hsp70 и hsp23, а гиперэкспрессия - увеличивает уровень индукции. Вклад менина в термоустойчивость дрозофилы пока не ясен.
Негативная регуляция также осуществляетя ацетилированием HSF1 (Westerheide et al., 2009). Показано, что в неактивном мономерном состоянии HSF1 ацетилирован по крайней мере по девяти остаткам лизина, из которых Лиз80, расположенный в ДНК-связывагощем домене, особенно важен, так как мутации по этому остатку приводят к потере HSF активности у дрожжей (Hubl et al., 1994; Torres, Bonner, 1995). Активация NAD-зависимой деацетилазы Sirtuinl (SIRT1) способствует приобретению HSF1 ДНК-связывающей активности и позволяет запустить процесс синтеза БТШ (Westerheide et al., 2009).